Einfluss der Eigenschaften verschiedener Graphene

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13408 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Verbundwerkstoffe aus Polymer- und Graphen-basierten Nanomaterialien (GBNs) kombinieren eine einfache Verarbeitung zu porösen 3D-Membrangeometrien aufgrund des Polymers und zelluläre Differenzierungsreize aufgrund von GBNs-Füllstoffen. Mit dem Ziel, die klinische Anwendung von Polymer/GBN-Verbundwerkstoffen voranzutreiben, führt diese Studie eine systematische und detaillierte vergleichende Analyse des Einflusses der Eigenschaften von vier verschiedenen GBNs durch: (i) Graphenoxid, das durch chemische Prozesse von Graphit gewonnen wird (GO); (ii) reduziertes Graphenoxid (rGO); (iii) mehrschichtiges Graphen, hergestellt durch mechanisches Peelingverfahren (Gmec); und (iv) niedrig oxidiertes Graphen durch anodische Exfoliation (Ganodic); dispergiert in porösen Membranen aus Polycaprolacton (PCL), um die Differenzierung von Astrozyten zu induzieren. PCL/GBN-Flachmembranen wurden durch Phaseninversionstechnik hergestellt und umfassend hinsichtlich Morphologie und Topographie, chemischer Struktur, Hydrophilie, Proteinadsorption und elektrischen Eigenschaften charakterisiert. Es wurden Zelltests mit Ratten-C6-Gliomzellen als Modell für zellspezifische Astrozyten durchgeführt. Bemerkenswerterweise verursachte eine niedrige GBN-Beladung (0,67 Gew.-%) einen wichtigen Unterschied in der Reaktion der C6-Differenzierung zwischen PCL/GBN-Membranen. PCL/rGO- und PCL/GO-Membranen zeigten die höchsten Biomolekülmarker für die Differenzierung von Astrozyten. Unsere Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die chemischen Strukturdefekte in rGO- und GO-Nanomaterialien und die Proteinadsorptionsmechanismen die plausibelste Ursache sind, die PCL/GBN-Membranen besondere Eigenschaften zur Förderung der Astrozytendifferenzierung verleihen. Insgesamt liefert unsere systematische Vergleichsstudie verallgemeinerbare Schlussfolgerungen und neue Erkenntnisse, um die Rolle von GBN-Merkmalen für zukünftige Forschungen zu 3D-PCL/Graphen-Verbundhohlfasermembranen für neuronale In-vitro-Modelle zu erkennen.

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​ist eine dynamische und komplexe Struktur von Gehirnkapillaren, die selektiv die Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) steuert und es vor Toxinen oder Krankheitserregern schützt1,2. Leider zeigten viele vielversprechende Therapiestrategien nicht die erwarteten Ergebnisse, da die BHS eine entscheidende Hürde für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen darstellt. Daher verhindert es aufgrund ihrer physikalischen, biochemischen und spezifischen Barriereeigenschaften, dass die meisten therapeutischen Medikamente in das Gehirn gelangen3,4.

Die Entwicklung neuronaler In-vitro-Modelle stellt eine potenziell wesentliche Wissensquelle für das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen und die Entwicklung neuartiger neuroprotektiver Therapien dar. Sie können eine Gelegenheit für die Planung neuer Arzneimittel-Screening-Plattformen auf der Grundlage neuronaler Zellkulturen für zelluläre Studien bieten, die auf neurologische Erkrankungen abzielen. Die Entwicklung von In-vitro-BBB-Modellen ist von größter Bedeutung, da sie dabei helfen, die Wirksamkeit neuer Medikamente und Therapeutika bei Hirnerkrankungen zuverlässig zu überprüfen. Die Entwicklung dynamischer BBB-Modelle (DIV-BBB), die kommerzielle Polymerhohlfasern als Plattformen für die Kultur von Endothelzellen in ihrer Lumenoberfläche verwenden und die physiologische Umgebung im Hinblick auf die Fluiddynamik nachbilden, hat gezeigt, dass die In-vitro-BBB-Rekonstruktion (gemessen) viel effizienter ist indirekt über den transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER)) als die Referenz-Transwell-Methode1,5. DIV-BBB-Modelle weisen jedoch immer noch viel niedrigere TEER-Werte auf als native BBB-Gewebe.

Die Co-Kultur von Endothelzellen mit Astrozyten wurde als effizientes Verfahren zur Verbesserung der BHS-Rekonstruktion in vitro vorgeschlagen, da beobachtet wurde, dass Astrozyten eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung und Funktion des Gehirns sowie bei der Regulierung des Endothelphänotyps spielen Zellen in BBB-Modellen durch die Regulierung der Zell-Zell-Kommunikation über lösliche Faktoren und direkte Interaktionen zwischen Astrozyten und Endothelzellen6. Bei Arbeiten an DIV-BBB-Modellen werden in der Regel Co-Kulturen von Endothel- und C6-Gliomzellen der Ratte verwendet, die durch Astrozyten induziert werden7,8,9. Die biochemischen Protokolle für die C6-Differenzierung sind irgendwie gut standardisiert und daher gehen diese Arbeiten von einer zufriedenstellenden Differenzierung der Astrozyten aus. Allerdings weisen die für diese Anwendung verwendeten kommerziellen Polymerhohlfasern (hauptsächlich Polypropylen und Polyvinylidendifluorid) eine schlechte Zelladhäsion auf und sind bioinert. Darüber hinaus haben wir in unserer früheren Arbeit10 beobachtet, dass trotz der Verwendung von Standardprotokollen zur Induktion der Astrozytendifferenzierung von C6-Zellen über der Oberfläche von Hohlfasern aus Polycaprolacton (PCL)-Polymer die Geschwindigkeit und Qualität der Differenzierung im Gegensatz zur Positivkontrolle mit Glasdeckgläsern begrenzt war.

PCL wird aufgrund seiner Verarbeitungsvielfalt (z. B. hohe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln und niedriger Schmelzpunkt), seiner mechanischen Eigenschaften und der Fähigkeit, je nach Porosität und Konformation technische dreidimensionale Strukturen als extrazelluläre Matrizen zu erzeugen, häufig als Zellkulturplattform verwendet des Gerüstes12,13. Darüber hinaus wurde PCL, das mithilfe einer nicht lösungsmittelinduzierten Trennung (NIPS) verarbeitet wurde, auf sein Potenzial als poröse Gerüste für die Reparatur von Hart- und Weichgewebe wie kleinen Blutgefäßen, die Regeneration von Nervengewebe und für die Entwicklung von vaskularisiertem Menschen untersucht Lebergewebe10,14,15,16. Tatsächlich hat es die Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) als chirurgische Implantate und Arzneimittelverabreichungsgeräte für Anwendungen im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin erhalten17. Um die begrenzte Astrozytendifferenzierung zu überwinden, die Polymere wie PCL in vitro fördern, wurden zahlreiche Ansätze untersucht, darunter Mischungsbildung, Oberflächenfunktionalisierung und die Einführung von Füllstoffen12,13.

In den letzten Jahren hat der Einsatz graphenbasierter Nanomaterialien (GBNs) in biomedizinischen Anwendungen wie der Arzneimittelverabreichung, Diagnosetests, Krebstherapie und Tissue Engineering erfolgreich zugenommen18,19. Eine breite Palette von Nanomaterialien wie Graphit, ein- oder wenigschichtiges Graphen (FLG), reduziertes Graphenoxid (rGO), Graphenoxid (GO), oberflächenfunktionalisierte Graphen-Nanomaterialien (stickstoffdotiert, mit Proteinen, Peptiden immobilisiert usw.) ) und ihre Derivate wurden berücksichtigt20. Sie haben eine gemeinsame Grundstruktur aus einer einzelnen Schicht sp2-hybridisierter Kohlenstoffatome, die in einem hexagonalen Gitter angeordnet sind. Ihre chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden sich jedoch je nach den verwendeten Herstellungsverfahren (mechanisches Peeling, elektrochemisches Peeling, chemische Gasphasenabscheidung, Lichtbogenentladung usw.). .)21,22. Vergleichsstudien verschiedener Dispersionen von GBN-Typen (FLG, GO und rGO) in Kontakt mit Astrozyten und neuralen Zelllinien bewiesen die Wirkung dieser Nanomaterialien auf die Mechanismen der Zelldifferenzierung durch GBN-Internalisierung23,24,25. Andere Arbeiten untersuchten die Biokompatibilität und mögliche Differenzierung von Zellen auf 2D-Filmsubstraten auf Graphenbasis26,27,28,29,30. Darüber hinaus konzentrierten sich einige Untersuchungen auf die Entwicklung von Verbundbiomaterialien auf Graphenbasis, die als Gerüste zur Förderung der Regeneration dysfunktionaler Nervengewebe dienen und die neuronale Differenzierung und Neurogenese verbessern20,31,32. Alle diese Studien haben positive Ergebnisse sowohl bei der Differenzierung neuronaler als auch nicht-neuronaler Zellen mit sehr unterschiedlichen GBNs wie unter anderem CVD-Graphen, rGO, GO und Wenigschicht-GO ergeben. Dennoch bleiben die große experimentelle und kommerzielle Variabilität von GBNs und die kontroversen Ergebnisse zu den zugrunde liegenden Mechanismen der Zelladhäsion, -proliferation und -differenzierung unklar und erfordern weitere Untersuchungen. Beispielsweise berichten bestimmte Arbeiten eindeutig, dass GO bessere neuronale Differenzierungsreaktionen aufweist23,33 als andere Arten von GBNs wie FLG oder makelloses Graphen, während andere Arbeiten entgegengesetzte Ergebnisse zeigen34,35. Alles in allem ist es gerechtfertigt, eine vergleichende Studie zu entwickeln, um eine Schlüsselfrage zu klären: Welche Eigenschaften müssen GBN haben, um eine neuronale Differenzierung zu induzieren?

Als Neuheit vergleicht diese Arbeit den Einfluss der Eigenschaften verschiedener GBNs unter denselben experimentellen Bedingungen auf die Differenzierung von Astrozyten, wobei PCL als Polymermatrix verwendet wird, was die Manipulation und anschließende praktische Verwendung bei der Entwicklung dynamischer In-vitro-Modelle erleichtert. Für die Vergleichsstudie wurden vier Arten von GBNs verwendet: (i) Gmec, ein mehrschichtiges Graphen, das durch mechanisches Peeling hergestellt wird; (ii) Ganodic, ein niedrig oxidiertes Graphen, das durch anodisches Peeling hergestellt wird; (iii) GO, hergestellt durch chemische Oxidation von Graphit und Peeling; und (iv) rGO, hergestellt durch hydrothermale Reduktion von GO. Der Einfachheit halber wurde die Analyse in flachen PCL/Graphen-basierten (PCL/GBN)-Verbundmembranen durchgeführt, die durch Phaseninversion synthetisiert wurden und charakterisiert wurden, um die Rolle der verschiedenen GBNs auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften und zellulären Mechanismen zu vergleichen, die an der Zelldifferenzierung beteiligt sind. Einige Studien deuten insbesondere darauf hin, dass Astrozyten als wichtige Vermittler der BHS-Bildung fungieren können, indem sie (i) funktionelle Barriereeigenschaften in Gehirnkapillaren induzieren (Bildung enger Verbindungen), (ii) architektonische Unterstützung für Neuronen bereitstellen und (iii) den Austausch regulieren von Molekülen in und aus dem Gehirn, (iv) Kontrolle und Modulation neurotoxischer Wirkungen und (v) Aufrechterhaltung der Gehirnhomöostase2,36. Infolgedessen wurden kultivierte Ratten-C6-Gliomzellen, die weithin als experimentelles Modell für die Differenzierung von Astrozyten37,38 beschrieben werden, für Zellstudien verwendet. Um den Grad der Astrozytendifferenzierung zu bestimmen, haben wir das Expressionsniveau zellspezifischer Astrozyten-Molekülmarker analysiert. Dazu gehören Gene, die für das fibrilläre Glia-Säureprotein (Gfap), ein wichtiges Zwischenfilamentprotein des Astrozyten-Zytoskeletts, und den Glutamat-Aspartat-Transporter (Glast) kodieren, der an der Pufferung von synaptisch freigesetztem Glutamat durch dessen Entfernung durch Aufnahme in Astrozyten beteiligt ist39,40. Darüber hinaus haben wir die Expression von Nestin-Protein untersucht, einem Bestandteil von Zwischenfilamenten, die in Astrozytenvorsprüngen angereichert sind und an der morphologischen Plastizität von Astrozyten während der ZNS-Entwicklung und -Verletzung beteiligt sind41.

Daher besteht das Hauptziel dieser Forschung darin, eine systematische und detaillierte Analyse der Auswirkungen der Eigenschaften von vier GBNs, die durch unterschiedliche Verfahren synthetisiert wurden, auf die Differenzierung von Astrozyten durchzuführen, um die Umsetzung in die klinische Anwendung voranzutreiben.

Abbildung 1A zeigt die FTIR-Spektren von Gmec-, Ganodic-, rGO- und GO-Nanomaterialien. Das GO-Spektrum zeigte das Vorhandensein von C-O-Alkoxy-Streckschwingungen42 bei 1047 cm-1, C-O-C-Epoxidgruppen bei 1220 cm-1 (Schultermerkmal)43, C-OH-Alkoholgruppen bei 1405 cm-1 und Skelett-C = C Schwingung graphitischer Domänen bei 1622 cm−1, C=O-Bindungen von Carbonsäure- und Carbonylgruppen bei 1726 cm−1 bzw. 2359 cm−1, zusätzlich zu einer breiten Bande von 3000 bis 3700 cm−1, entsprechend die Hydroxyl-OH-Gruppe44,45. Im Gegensatz dazu traten in den anderen GBNs nur schwache Banden von C=C- und C=O-Bindungen auf, was auf die Knappheit oder gar Abwesenheit sauerstoffhaltiger funktioneller Gruppen schließen lässt.

Charakterisierung von Gmec-, Ganodic-, rGO- und GO-Nanomaterialien durch (A) FTIR- und (B) Raman-Spektroskopie. XPS-Spektrenentfaltung von Kohlenstoffpeaks für (C) Gmec, (D) Ganodic, (E) rGO und (F) GO. Die experimentellen Spektren (schwarze Spur) werden in fünf Komponenten zerlegt: graphitisches Kohlenstoffband mit einem Maximum bei der Bindungsenergie (BE) ~ 284,5 eV (graue Spur); Kohlenstoff, der einfach an Epoxid- und Hydroxylgruppen gebunden ist, liegt etwa 2 eV höher in BE als die vorherige Komponente (blau); doppelt gebundener Kohlenstoff in Carbonylgruppen ~ 3,5 eV höher in BE als die graphitische Komponente (rot); Kohlenstoff in Carboxylgruppen (~ 4,5 eV höher, grün); und \({\uppi } \to {\uppi }\)* Satellit des graphitischen Signals (~ 6,5 eV höher, Magenta).

Abbildung 1B zeigt die Raman-Spektren der GBNs in absolut willkürlichen Einheiten mit drei charakteristischen Bändern: D, G und 2D. Das D-Band wird einem Atmungsmodus mit A1g-Symmetrie bei 1354 cm-1 zugeschrieben, der mit dem Vorhandensein von sp3-Störungsstellen oder strukturellen Defekten wie Leerstellen und Kantendefekten verbunden ist46,47. Das G-Band ist eine Streuung erster Ordnung des E2g-Modus und entsteht aus den C=C-Streckschwingungen von sp2-gebundenen Kohlenstoffen in Graphenebenen bei 1580 cm−1. Schließlich ist das 2D-Band bei 2690 cm−1 eine Schwingung zweiter Ordnung des D-Bandes, die durch die Streuung von Phononen an der Zonengrenze der Graphitebene verursacht wird48. Das Intensitätsverhältnis der D- und G-Banden (ID/IG) wurde berechnet49,50. Für Gmec und Ganodic betrugen die ID/IG-Verhältnisse 0,20 ± 0,07 bzw. 0,22 ± 0,03. Im Gegensatz dazu trat das D-Band aufgrund des hohen Vorhandenseins von Defekten stark auf GO- und rGO-Nanomaterialien auf, und das ID/IG-Verhältnis von 0,84 ± 0,06 für GO stieg aufgrund des Reduktionsprozesses auf 1,01 ± 0,12 für rGO47,50 . Darüber hinaus verdeutlicht das I2D/IG-Verhältnis den Übergang sp2-hybridisierter Kohlenstoffbindungen von kristallinen Nanomaterialien in einen amorphen Zustand und gibt Aufschluss über die strukturelle Qualität der Materialien51. Die höheren I2D/IG-Verhältnisse von Gmec (0,35 ± 0,01) und Ganodic (0,36 ± 0,01) im Vergleich zu rGO (0,05 ± 0,03) und GO (0,01 ± 0,01) verdeutlichten die höhere strukturelle Qualität dieser Nanomaterialien. Das niedrige I2D/IG-Verhältnis von rGO- und GO-GBNs könnte mit dem Aufbrechen des sp2-hybridisierten Gitters durch die Einführung von funktionellen Sauerstoffgruppen und dem Vorhandensein von Defekten zusammenhängen, was auch die Verschiebung der G-Bande von 1580 auf 1590 cm−1 erklärt sowohl auf GO als auch auf rGO51,52. Schließlich wurde die scheinbare Kristallitgröße in der Ebene entlang der kristallographischen a-Achse (La) mit Werten von 96 nm, 87 nm, 19 nm bzw. 23 nm für Gmec-, Ganodic-, rGO- und GO-Nanomaterialien berechnet. Die niedrigen La-Werte von rGO- und GO-Nanomaterialien könnten auf das Vorhandensein von funktionellen Sauerstoffgruppen und damit verbundenen Strukturstörungen (sp3-Hybridisierung, Leerstellendefekte, Nadellöcher usw.) im Graphengitter zurückgeführt werden51.

Abbildung 1C–F zeigt die Entfaltung der XPS-Spektren auf Kernebene von C 1 für alle GBNs. Ebenso sind in Tabelle 1 die verschiedenen Bindungsarten zwischen Kohlenstoffatomen und Sauerstoffatomen aufgeführt. Bemerkenswerterweise zeigten die entfalteten Kurven der Nanomaterialien Gmec (Abb. 1C), Ganodic (Abb. 1D) und rGO (Abb. 1E) den begrenzten Oxidationsgrad dieser GBNs mit einem hohen Atomanteil an graphitischem C und einem hohen Grad der elektronischen Konjugation (\({\uppi } \to {\uppi }\)* Satellitenband) in diesen Proben (Tabelle 1). In rGO befanden sich nach dem Reduktionsprozess noch einige Epoxid- und Hydroxylgruppen im Nanomaterial. Bemerkenswerterweise spiegelt sich das geringe Vorhandensein aromatischer Domänen in GO (Abb. 1F) in der geringen Intensität des Satelliten \({\uppi } \to {\uppi }\)* wider, der mit seinem Graphitsignal verbunden ist (Tabelle 1). XPS-Vermessungsspektren (Abb. S1) bestätigten das Vorhandensein von C und O in GBNs, mit C 1 s- und O 1 s-Kernniveaus bei 284,5 eV bzw. ∼ 532 eV54. Tabelle S1 zeigt die Elementzusammensetzung der GBNs mit einem Sauerstoffatomanteil von GO (29,4 %) > rGO (10,8 %) > Gmec (3,6 %) > Ganodic (3,0 %). Wir stellen fest, dass der Sauerstoffgehalt zwar im Prinzip auch anhand der in Tabelle 1 gesammelten Daten ermittelt werden könnte, indem einige Annahmen über den Bindungstyp (z. B. Epoxid oder Hydroxyl) getroffen werden, die intrinsische Asymmetrie des graphitischen Kohlenstoffbandes jedoch normalerweise dazu führen würde eine Überschätzung des Sauerstoffatomprozentsatzes. Selbst wenn die Graphitbänder mit einer asymmetrischen Funktion versehen werden, wie in der vorliegenden Arbeit (Einzelheiten siehe „Synthese und Charakterisierung von Nanomaterialien auf Graphenbasis“), wird ein Teil der Intensität, die tatsächlich vom Ende des Graphitsignals kommt, falsch zugeordnet zu sauerstoffhaltigen Gruppen. Obwohl der Sauerstoffgehalt anhand der Untersuchungsspektren genauer bestimmt werden kann (Tabelle S1), sind die Entfaltungsdaten dennoch für einen halbquantitativen Vergleich zwischen den verschiedenen Materialien nützlich (Tabelle 1).

Kurz gesagt, Graphendefekte hängen im Allgemeinen mit sp3-Kohlenstoff in Korngrenzen, sauerstoffhaltigen Gruppen oder graphitischen Bindungslücken zusammen. Gmec und Ganodic haben einen hohen Anteil an graphitischem Kohlenstoff und einen niedrigen Sauerstoffgehalt. Daher könnte die geringe Menge an Defekten, die diese GBNs aufweisen, hauptsächlich auf Korngrenzendefekte zurückgeführt werden. GO hat einen hohen Anteil an Sauerstoffgruppen, was den geringen Graphitkohlenstoffgehalt in diesem Material erklärt. Mittlerweile hat rGO den graphitischen Kohlenstoffgehalt teilweise zurückgewonnen und weist im Gegensatz zu GO eine Verringerung des Sauerstoffgehalts auf, Raman-Daten deuten jedoch auf ein ähnliches Ausmaß an Strukturdefekten wie GO hin. Dies könnte durch das Vorhandensein graphitischer Bindungslücken in rGO erklärt werden, die typischerweise während des Reduktionsprozesses von GO entstehen.

Abbildung 2A–E und F–J zeigen REM-Bilder von PCL/GBN-Membranen mit Oberflächen- bzw. Querschnittsmorphologie, die je nach eingebautem GBN unterschiedliche Morphologien aufweisen. In Tabelle 2 sind die Dicke, die Volumenporosität, die Oberflächenporosität sowie sowohl die durchschnittliche Oberflächenporengröße als auch die Porenquerschnittsgröße der Membranen aufgeführt.

(A–E) REM-Bilder der Oberseite und (F–J) Querschnitt der PCL- und PCL/GBN-Membranen. Maßstabsbalken 30 µm.

PCL/GBNs-Membranen weisen im Vergleich zu PCL eine ähnliche Dicke und Volumenporosität ohne signifikanten statistischen Unterschied auf (Tabelle 2). Alle Membranen wiesen eine innere schwammartige Struktur mit geschlossenzelligen Mikroporen auf, die für phasengetrennte Polymermembranen charakteristisch ist55. Darüber hinaus wiesen sie eine hohe Volumenporosität (~ 70 %) und Interkonnektivität zwischen Poren auf, die potenziell günstige Nährstofftransporteigenschaften bieten, den molekularen Transfer fördern und für die Zelladhäsion und -proliferation geeignet sein könnten. Die Oberflächenporosität (Abb. 2A–E) blieb bei der Einführung von GBNs ähnlich, mit Ausnahme der PCL/Gmec-Membranen, die von 31,3 ± 2,2 % für PCL auf 24,7 ± 1,7 % reduziert wurde. Ein ähnliches Verhalten wurde für die durchschnittliche Oberflächenporengröße beobachtet. Es ist bemerkenswert, dass die durchschnittliche Porenquerschnittsgröße von PCL/GO-Membranen deutlich größer war als die von PCL-Membranen (Tabelle 2). Dies könnte mit dem hohen O/C-Atomverhältnis von 0,44 in GO zusammenhängen, sodass letzteres über die Bildung von Wasserstoffbrücken Moleküle des IPA-Koagulans anziehen und so die Phasentrennung beschleunigen könnte.

Abbildung 3A–D zeigt die Raman-Spektren und optischen Bilder von PCL/GBN-Oberflächenmembranen zur Bewertung der Dispersion der GBNs. Die unterschiedlichen IG/ICH2-Verhältnisse führten zu einer unterschiedlichen Verteilung der GBNs über die Membranoberfläche mit einem Grad an Homogenität in der Dispersion wie folgt: PCL/GO > PCL/Ganodic > PCL/rGO > PCL/Gmec. Insbesondere auf PCL/Gmec-Membranen (Abb. 3A) gab es Bereiche, in denen kein Gmec nachgewiesen wurde. Im Gegensatz dazu zeigten die übrigen PCL/GBN-Membranen an jedem auf der Oberfläche gemessenen Punkt eine GBN-Konzentration. Bemerkenswert ist auch die geringe absolute Intensität des Raman-Spektrums von PCL/Ganodischen Membranen (Abb. 3B) und das Vorhandensein von GO-entsprechenden Banden hoher Intensität auf der gesamten PCL/GO-Oberfläche (Abb. 3D). Raman- und FTIR-Spektroskopie in Abb. S2A bzw. B bestätigen das Vorhandensein charakteristischer GBN-Banden in den PCL-Membranen.

Physikalisch-chemische Charakterisierung und elektrische Eigenschaften von PCL- und PCL/GBN-Membranen. Raman-Spektren und optische Bilder einer Oberflächenkartierung von 100 × 100 µm für (A) PCL/Gmec-, (B) PCL/Ganodic-, (C) PCL/rGO- und (D) PCL/GO-Membranen. Die Streuung der GBNs wird durch Berechnungen des IG/ICH2-Verhältnisses an jedem einzelnen Punkt dargestellt. Die Punkte (1) und (2) weisen einen niedrigeren bzw. höheren Gehalt an GBNs auf, und ○ stellt die Analysezone durch den Raman-Konfokallaser dar. (E) Elektrische Leitfähigkeit und (F) dielektrische Permittivitätseigenschaften. Statistische Signifikanz in Bezug auf PCL (*p < 0,05; **p < 0,01).

Die elektrische Leitfähigkeit und die dielektrische Permittivität (Abb. 3E, F) wurden durch Impedanzmessungen bei 1184 Hz, 53.915 Hz und 105.780 Hz bewertet. Es muss berücksichtigt werden, dass unter physiologischen Bedingungen im Tierversuch56 Frequenzen von mindestens 1000 Hz erforderlich sind, um die elektrische Leitung durch neuronale Axone zu induzieren. Im Allgemeinen zeigten alle Membranen das für elektrische Isolatoren typische Verhalten, wobei die elektrische Leitfähigkeit mit zunehmender Frequenz zunahm (Abb. 3E) und die dielektrische Permittivität abnahm (Abb. 3F). Die niedrige elektrische Leitfähigkeit von PCL-Membranen war vergleichbar mit dem an anderer Stelle angegebenen Wert57,58, was das Isolatorverhalten dieses Polymers bestätigt. Insbesondere ähnelten die für PCL- (5,5·10–4 S m−1) und PCL/rGO-Membranen (7,1·10–4 S m−1) gefundenen elektrischen Leitfähigkeiten den zuvor von Sánchez-González et al.59 berichteten Werten (9,9·10–4 S m−1 und 1,8·10–3 S m−1 für PCL- bzw. PCL/rGO-Membranen). Daher gab es keine signifikanten Verbesserungen der elektrischen Masseneigenschaften, als GBNs in die Polymermatrix eingebracht wurden, da die Konzentration der geladenen Nanopartikel von 0,1 Gew.-% nicht ausreichte, um die elektrische Perkolationsschwelle zu erreichen13,48. Dennoch ist ein deutlicher Rückgang der elektrischen Leitfähigkeitseigenschaften für PCL/Gmec- und PCL/GO-Membranen im Vergleich zu PCL bemerkenswert.

Die Oberflächenrauheit von PCL- und PCL/GBN-Membranen (Abb. 4A–E) nahm in der Reihenfolge zu: PCL/Gmec < PCL/GO < PCL < PCL/Ganodic < PCL/rGO, wobei die Werte eine topografische Rauheit im Mikrobereich zeigen und ohne statistische Angaben erhebliche Unterschiede zwischen den Proben. Abbildung 4F zeigt Wasserkontaktwinkelwerte (WCA) von 93 ± 5°, 118 ± 5°, 104 ± 4°, 91 ± 5° und 87 ± 5° für PCL, PCL/Gmec, PCL/Ganodic, PCL/rGO bzw. PCL/GO. Die Einführung von Gmec- und Ganodic-Nanoplättchen erhöhte die Hydrophobie der entsprechenden Verbundmembran im Vergleich zu reinem PCL aufgrund der hydrophoben Natur dieser GBNs49 deutlich. In Übereinstimmung mit anderen Arbeiten47,59 zeigten PCL/rGO-Membranen im Vergleich zu PCL keine signifikante Veränderung des WCA. Der statistisch signifikante Anstieg der Hydrophilie in PCL/GO-Membranen könnte auf das Vorhandensein funktioneller Gruppen auf dem GO-Nanomaterial sowie auf die bevorzugte Position dieses Nanomaterials an der Membranoberfläche während des Phaseninversionsprozesses zurückgeführt werden59, wie durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen wurde (Abb. 3D).

Topografische und Proteinadsorptionscharakterisierung von PCL- und PCL/GBN-Membranen. 3D-Bilder von 40 × 40 μm großen Scanbereichen und Oberflächenrauheitswerte mittels AFM für (A) PCL-, (B) PCL/Gmec-, (C) PCL/Ganodic-, (D) PCL/rGO- und (E) PCL/GO-Membranen . (F) WCA-Messungen auf Membranoberflächen. (G) Gesamtadsorption von BSA-Modellprotein und DMEM + 10 % FBS-Zellkulturmedium auf Flachmembranen. Statistische Signifikanz in Bezug auf PCL (*p < 0,05; **p < 0,01).

Die Adsorption des einzelnen BSA-Modellproteins und der DMEM + 10 % FBS-Mischung wurde auf den verschiedenen Membranen untersucht (Abb. 4G). PCL/Ganodic-Membranen zeigten die höchste Proteinadsorption (51 ± 2 µg·cm−2 für BSA und 92 ± 7 µg·cm−2 für DMEM + 10 % FBS), gefolgt von PCL/Gmec und PCL/rGO und deutlich höher als PCL-Membranen. Andererseits zeigten PCL/GO-Membranen die geringste Proteinadsorption unter allen PCL/GBN-Membranen. Die Proteinadsorptionskapazität auf PCL/Gmec-, PCL/Ganodic- und PCL/rGO-Membranen kann einem Physisorptionsprozess zugeschrieben werden, der durch π-π-Wechselwirkungen und hydrophobe Kräfte gesteuert wird60. In PCL/GO-Membranen trägt das hohe Vorhandensein von Sauerstoffgruppen zur Adsorption von Proteinen bei61,62. Dennoch zeigten die REM-Bilder der Oberfläche der Membranen (Abb. 2A–E) eine poröse Oberflächenmorphologie in PCL/GO-Membranen (Abb. 2E) mit möglicherweise geringerer effektiver Adsorptionsfläche als bei den übrigen Membranen. Dies könnte zu einem Artefakt bei der Normalisierung der pro Membranoberfläche adsorbierten Proteinmasse führen und die ungewöhnlich niedrigen Proteinadsorptionsergebnisse für PCL/GO-Membranen erklären.

Die Morphologie und Differenzierung von C6-Zellen zu Astrozyten wurde in PCL- und PCL/GBN-Membranen analysiert (Abb. 5). Abbildung 5A–E zeigt C6-Zellen, die mit FITC-konjugiertem Phalloidin für F-Aktin von Mikrofilamenten gefärbt wurden. Nach 5 Tagen Differenzierung zeigten C6-Zellen die charakteristische Verringerung des fluoreszierenden Aktin-Zytoskelettsignals in allen flachen Membranen. Insbesondere zeigten Abb. 5D, E eine spindelförmige Morphologie in C6-Zellen mit der Bildung langer dünner zytoplasmatischer Vorsprünge. In ähnlicher Weise wurden C6-Zellen auf Glasdeckgläsern als positive Kontrollen der Astrozytendifferenzierung gezüchtet (Abb. S3). Sie zeigten dramatische morphologische Veränderungen von einer flachen polygonalen Form und einem gut definierten Aktin-Zytoskelett, einschließlich der charakteristischen Stressfasern des Adhäsionsstadiums am Tag 0 der Differenzierung (Abb. S3A, B), zu einer bevorzugten spindelförmigen Morphologie mit langen, schlanken Zellverlängerungen am Tag 5 der Astrozytendifferenzierung (Abb. S3C, D). Der Prozentsatz der C6-Zelldifferenzierung ist in Abb. 5F dargestellt. Für Positivkontrollen wurde ein Wert von 54,2 ± 3,4 % erhalten, während der Wert für Membranen in der folgenden Reihenfolge abnahm: PCL/GO (26,3 ± 5,5 %) > PCL/rGO (22,3 ± 2,7 %) > PCL/Ganodic (9,1 ± 0,7 %) > PCL/Gmec (8,8 ± 2,7 %) > PCL (4,7 ± 2,7 %). Insbesondere PCL-, PCL/Gmec- und PCL/Ganodic-Membranen ergaben eine runde Zellmorphologie (Abb. 5A – C) und 60–75 % der gesamten Zellen zeigten nur eine Zellprojektion (Abb. 5G). Bemerkenswerterweise bildeten auf PCL/Gmec kultivierte C6-Zellen (Abb. 5B) Zellcluster, die wie bereits berichtet 63 mehrzelligen kugelförmigen Strukturen ähnelten. Im Gegensatz dazu stimulierten PCL/rGO- und PCL/GO-Membranen die Bildung von zwei bis fünf Zellverlängerungen erheblich, was der typischen Sternmorphologie von Astrozyten ähnelt (Abb. 5D, E, G). Sowohl PCL/rGO- als auch PCL/GO-Membranen förderten eine deutliche Veränderung der Zellform zu einer asymmetrischen Form mit verlängerten Fortsätzen. Etwa 22 % bzw. 31 % der C6-Zellen zeigten mehr als zwei Projektionen auf PCL/rGO- bzw. PCL/GO-Membranen, ein Anteil, der deutlich höher ist als der geschätzte Wert für C6-Zellen, die auf Glasdeckgläsern gezüchtet wurden (Positivkontrollen), wo nur 3 % der Zellen hatten mehr als zwei Zellvorsprünge.

Morphologische Analyse der Differenzierung von C6-Zellen zu mit Phalloidin-FITC gefärbten Astrozyten auf (A) PCL-, (B) PCL/Gmec-, (C) PCL/Ganodic-, (D) PCL/rGO- und (E) PCL/GO-Flachmembranen durch Konfokale Bilder. Maßstabsbalken = 30 µm. Quantifizierung von (F) C6-differenzierten Zellen nach 5 Tagen dbcAMP-Behandlung und (G) Anzahl der Projektionen pro Zelle auf Positivkontrollen und Flachmembranen. (H) Normalisierte mRNA-Expression von Gfap- und Glast-Genen, bewertet durch quantitative Echtzeit-PCR, und (I) Nestin-Proteinexpression, quantifiziert durch Western Blot, was die Differenzierung von C6-Zellen zeigt. Alle Western-Blot-Bilder sind in Abb. S4 dargestellt. Statistische Signifikanz in Bezug auf PCL (**p < 0,01; n ≥ 4).

Darüber hinaus wurden die Veränderungen in der Expression von Genen analysiert, die für zwei Schlüsselproteine, Gfap und Glast, für die Differenzierung von C6-Zellen zu Astrozyten kodieren. Die RT-qPCR-Analyse der Gfap-Expression in C6-Zellen, die auf den untersuchten Membranen gezüchtet wurden, zeigte die folgenden relativen mRNA-Spiegel: PCL/Ganodic (2,60 ± 0,16) > PCL/GO (2,37 ± 0,15) > PCL/rGO (2,33 ± 0,16) > PCL /Gmec (1,34 ± 0,13). Interessanterweise waren die Expressionsniveaus in PCL/Ganodic-, PCL/GO- und PCL/rGO-Membranen im Vergleich zu den auf 1 normalisierten PCL-Membranen signifikant höher (Abb. 5H). Bezüglich der Slc1a3 (Glast)-Expression zeigten nur C6-Zellen, die auf PCL/rGO-Membranen (1,66 ± 0,31) und PCL/GO-Membranen (2,97 ± 0,06) gezüchtet wurden, signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu C6-Zellen, die auf PCL-Membranen kultiviert wurden (Abb. 5H). Schließlich zeigt Abb. 5I das Western Blot von Zelllysaten, das einen relativen 1,6-fachen Anstieg der Nestin-Proteinexpression in C6-Zellen zeigt, die auf PCL/rGO- und PCL/GO-Membranen im Vergleich zu PCL kultiviert wurden.

Unterschiedliche GBN-Eigenschaften können die Eigenschaften der PCL/GBN-Membran beeinflussen und unterschiedliche zelluläre Reaktionen und Zell-Material-Wechselwirkungen hervorrufen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Einführung einer theoretischen Konzentration von 0,67 Gew.-% rGO- und GO-Nanomaterialien in die PCL-Polymermatrix den Prozentsatz differenzierter C6-Zellen sowie die Anzahl ihrer Zellverlängerungen im Vergleich zu PCL und anderen PCL/ GBN-Membranen. Darüber hinaus nahmen die mRNAs von Gfap und slc1a3 (Glast) sowie die Nestin-Proteinexpression sowohl in PCL/rGO- als auch in PCL/GO-Membranen zu. Insbesondere ist Gfap ein Astrozyten-Zwischenfilamentprotein, das eine Schlüsselrolle sowohl bei der Bestimmung der Zellform als auch bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Unterstützung für das räumliche Astrozytennetzwerk des ZNS spielt. Insbesondere perivaskuläre Astrozyten sind für die Etablierung der Blut-Hirn-Schranke von entscheidender Bedeutung, einschließlich der Barriereeigenschaften von Endothelzellen (Tight Junctions) und des selektiven Transports von Wasser und verschiedenen gelösten Stoffen der Blut-Hirn-Schranke in das und aus dem Gehirn41,64. Daher ist die Expression von Gfap für eine erfolgreiche C6-Zelldifferenzierung in Richtung Astrozyten erforderlich. Der Anstieg der Gfap-Expression auf PCL/Ganodic-, PCL/GO- und PCL/rGO-Membranen um mehr als das 2,3-fache war vergleichbar mit den in der Literatur erhaltenen Ergebnissen für 3D-Gerüste65,66,67. In diesem Zusammenhang zeigten Song et al.65, dass der Einbau von 0,1 Gew.-% GO auf PCL/GO-Nanofasern die Expression von Gfap in neuronenähnlichen Ratten-Phäochromozytomzellen (PC12-Linie) um das 1,7-fache steigerte, während neurale Stammzellen (NSCs ) differenzierten sich auf rGO-Mikrofasern oder Graphenschäumen positiv zu Astrozyten und steigerten die Expression von Gfap um das 1,43-fache bzw. 2,5-fache66,67. Darüber hinaus halten die Puffereigenschaften von Astrozyten-Glutamattransportern wie Glast die extrazellulären Glutamatspiegel im Gehirn auf niedrigen Konzentrationen, da seine Anreicherung im synaptischen Raum zu neuronaler Überstimulation und Exzitotoxizität führt und an mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt ist64,68. Mehrere Arbeiten berichteten über die Glast-Lokalisierung in der Zellmembran und Zellverlängerungen in kultivierten Astrozyten aus Rattenhirn36,64,68. Interessanterweise stellten einige Autoren eine funktionale Überschneidung zwischen Gfap und Glast fest69,70. Chiacchiaretta et al.23 beschrieben, dass Astrozyten aktiv mit verschiedenen GBNs interagieren, ihre Sternbildung fördern und die Gfap-Immunreaktivität und die Glutamataufnahme erhöhen, während Sullivan et al.70 vorschlugen, dass das Gfap-Protein die Retention des Glast-Transporters über intermediäre Proteine ​​in der Plasmamembran ermöglicht begünstigen die Glutamathomöostase. Obwohl PCL/Ganodic-Membranen eine hohe Fähigkeit zur Aktivierung der Gfap-Expression in Zellen aufwiesen (Abb. 5H), könnte die gemeinsame Beteiligung von Gfap und Glast entscheidend für die Förderung der Reorganisation des Zytoskeletts, des Wachstums von Zellverlängerungen und der Glutamataufnahme während der Astrozytendifferenzierung sein .

Schließlich ist Nestin eines der Zwischenfilamente, die in den frühesten Stadien der Gehirnentwicklung exprimiert werden, und es kommt in Zellvorsprüngen sowie an den Wachstumsspitzen astroglialer Zellfortsätze vor. Nestin kann mit Vimentin oder Gfap als obligatorischen Partnern heteropolymere Filamente bilden. Tatsächlich wurde festgestellt, dass Gfap die Dynamik des Nestin-Netzwerks kontrolliert41,64. In diesem Sinne berichteten Guo et al.66, wie in unserer Arbeit geschehen, auch über das Vorhandensein von Nestin-positiven Zellen auf rGO-Mikrofasern nach 3 Tagen NSC-Kultur.

Es ist wichtig, die möglichen Zell-Material-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit den durchgeführten Substratcharakterisierungen zu untersuchen, die die Förderung und Modulation der Differenzierung von C6-Zellen in Richtung Astrozyten dank der Zugabe von GBNs erklären könnten. Abbildung 6 zeigt die möglichen physikalisch-chemischen Eigenschaften von GBNs, die möglicherweise zelluläre Differenzierungsprozesse beeinflussen: (i) biomolekulare Wechselwirkungen, (ii) elektrische Eigenschaften und (iii) Topographie und lokale Steifigkeit.

Die zugrunde liegenden Mechanismen hinter der Modulation der Zelldifferenzierung aufgrund des Vorhandenseins von GBNs: (A) biomolekulare Wechselwirkungen, (B) elektrische Eigenschaften und (C) Oberflächentopographie und lokaler Steifheitseinfluss [adaptiert von Luong-Van et al.52].

Die biomolekularen Wechselwirkungen (Abb. 6A) stellen die Fähigkeit von GBNs dar, Proteine, Wachstumsfaktoren und Biomoleküle durch verschiedene chemische Wechselwirkungen wie Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatische Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen und \({\uppi } - {\uppi }\ zu binden. ) Fesseln. Diese Wechselwirkungen könnten ihre lokale Bioverfügbarkeit erhöhen, starke Zell-Material-Wechselwirkungen fördern und unterschiedliche zelluläre Reaktionen hervorrufen27,52. Diese Hypothese konnte bestätigt werden, da wir nach einem Tag Zellkultur beobachteten, dass GBNs die Bindung und Proliferation von C6-Zellen stark verbesserten, was mit der Verbesserung der Adsorption von Kulturmediumproteinen zusammenhängen könnte (Abb. 4G). So wurde die Proteinadsorption auf GBN-Membranen durch hydrophobe und \({\uppi } - {\uppi }\)-Wechselwirkungen gefördert, die mit den erweiterten elektronisch konjugierten (aromatischen) Domänen in Gmec, Ganodic und rGO verbunden sind, wie durch XPS gezeigt (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu waren solche Domänen in GO weniger häufig anzutreffen, was auf Proteinadsorptionsniveaus hindeutet, die mit denen von PCL vergleichbar waren. Darüber hinaus weist die Oberflächenmorphologie der PCL/Ganodic-Membran (Abb. 2C) Hohlräume auf, die als Molekülreservoirs fungieren können, was zu einer höheren effektiven spezifischen Oberfläche als bei einer flachen Oberfläche und damit zu einer erhöhten Proteinadsorption führt. Für BSA-Protein wurde die starke Wechselwirkung mit hydrophoben Biomaterialien zuvor der intermolekularen Protein-Substrat-Bindung über hydrophobe Flecken und Aminosäureketten zugeschrieben 27,28,32. Darüber hinaus wurde die deutlich geringere BSA-Adsorption auf PCL/rGO- und PCL/GO-Membranen durch das Vorhandensein elektrostatischer Abstoßungen zwischen dem negativ geladenen Protein bei pH 7,471 und den Sauerstoffgruppen begründet, was durch einen Sauerstoffgehalt von 10,8 Atom-% und 29,5 Atom-% bestätigt wurde. für rGO bzw. GO (Tabelle S1). Vermutlich verringerte diese elektrostatische Abstoßung die Adsorption von BSA auf PCL/rGO- und PCL/GO-Membranoberflächen und könnte zu einer stärkeren Adsorption anderer Proteine ​​wie Fibronektin, Laminin oder Vitronektin führen, die drei Bestandteile der Zellmatrix und der Kulturmedien sind eine wichtige Rolle bei der zellulären Bindung an das Substrat, der Modulation des Verhaltens von NSCs sowie dem neuronalen Wachstum und der Migration61,72. Bemerkenswert ist, dass das Laminin-Protein mit Membranproteinen wie dem Lamin-B-Rezeptor interagiert und diese kontrolliert, wodurch die Verbindung der extrazellulären Matrix der Zellmembran mit Chromatin verstärkt und die Zelldifferenzierung gefördert wird73,74. Insbesondere wurde gezeigt, dass Laminine in vitro als haptotaktische Faktoren wirken, also die Migration von Astrozyten induzieren und deren Differenzierung fördern75. Daher kann die geringere Adsorption des globulären BSA-Proteins auf PCL/rGO und PCL/GO die Adsorption des Laminin-Proteins und, was noch wichtiger ist, die Förderung einer direkten Verbindung zwischen den Zellrezeptoren und der Membranoberfläche fördern, wodurch die Zelldifferenzierung ausgelöst wird.

Mit Blick auf die Benetzbarkeit kann der hydrophile Charakter von Oberflächensubstraten zu einer erhöhten Zellverankerung führen, indem der Grad des Kontakts zwischen Zellrezeptoren und der physiologischen Umgebung verbessert wird76. PCL/GO-Membranen waren mit einem WCA von 87 ± 5° leicht hydrophil, während die anderen Membranen mit Durchschnittswerten über 90° hydrophober waren. Die Wechselwirkung zwischen dem Wassertropfen und der Oberfläche von PCL/GO-Membranen verringerte den WCA für diese Membranen aufgrund der Anwesenheit sauerstoffhaltiger Gruppen. Darüber hinaus könnten ihre elektrostatischen Wechselwirkungen die physikalisch-chemischen Verbindungen zwischen Zellen und Oberflächen verbessern, wie dies auch in anderen Arbeiten der Fall war28,77.

Ein weiterer kritischer Punkt ist das Vorhandensein struktureller und chemischer Defekte auf GBNs in Form hochreaktiver Stellen oder „Hot Spots“ für Protein- und Zell-Material-Wechselwirkungen28,52,61. Die chemische Oxidation und Abblätterung von Graphit für die GO-Produktion und die anschließende hydrothermale Reduktion zur Gewinnung von rGO führten zu strukturellen und chemischen Defekten, die die sp2-Kohlenstoffhybridisierung veränderten und die Benzolringstruktur verzerrten, mit Durchschnittswerten von 0,84 und 1,01 für ID/IG-Verhältnisse. jeweils. Im Gegensatz dazu wiesen Gmec- und Ganodic-Nanomaterialien weniger Defekte auf, was aufgrund ihrer Synthesemethode zu erwarten war. Darüber hinaus stützen die niedrigsten I2D/IG-Werte, die zuvor für rGO- und GO-Nanomaterialien ermittelt wurden, den Beweis für den höchsten Grad an struktureller Unordnung bei diesen Nanomaterialien, da die 2D-Bande bei Vorhandensein großer Unordnungsmengen tendenziell abnimmt50. Das hohe Vorhandensein von Leerstellen und Kantendefekten sowie strukturelle Unordnung in rGO- und GO-GBNs könnten hochreaktive Stellen und größere Einkerbungstiefen liefern, um nicht nur die Proteinadsorption, sondern auch Zell-Material-Wechselwirkungen und -Verankerungen zu verbessern, die wahrscheinlich die Zelldifferenzierungsprozesse beeinflussen. Daher führt das Vorhandensein von Defekten auf GBNs wahrscheinlich zu einem direkten Kontakt zwischen den Rezeptoren der Zellmembran und der Membranoberfläche, wodurch intrazelluläre Kaskaden ausgelöst werden, die die Differenzierungsreaktion modulieren und möglicherweise das Zellschicksal beeinflussen würden.

Der zweite Mechanismus beinhaltet die entscheidende Rolle der elektrischen Eigenschaften in Nervengeweben und der Zelldifferenzierung, wo die Zellkommunikation stark auf elektrischen Signalen beruht, wie in Abb. 6B dargestellt. In mehreren Arbeiten wurde berichtet, dass elektrisch leitende Umgebungen die biologische Aktivität lokal modulieren und zu einer besseren Zelldifferenzierung führen können, beispielsweise zum Auswachsen und Sprießen von Neuriten20,52,76. Auf diese Weise schlugen Sánchez-González et al.59 vor, dass die höchste neuronale Aktivität reifer neuronaler Vorläuferzellen, die auf PCL/rGO-Membranen gezüchtet wurden, auf deren höhere elektrische Eigenschaften im Vergleich zu PCL- und PCL/GO-Membranen zurückzuführen ist. Daher wurde der elektrisch leitende Charakter der Gerüste bewertet. Alle Membranen zeigten ein isolierendes Verhalten (Abb. 3E, F), obwohl bei PCL/Gmec- und PCL/GO-Membranen eine geringfügige Verringerung der elektrischen Eigenschaften beobachtet wurde. Bei PCL/Gmec wurde dies auf die mechanisch abgeblätterte Gmec-Natur und die Bildung großer Nanoplättchenaggregate mit nichtleitenden Pfaden (Abb. 3A) zurückgeführt, die Ladungstransportnetzwerke behinderten, wie bereits von Xia et al.78 für Graphen vorgeschlagen. Polymer-Nanokomposite. Bei PCL/GO-Membranen könnten die großen Poren im Querschnitt (Abb. 2J) aufgrund der größeren Abstände zwischen den leitfähigen Nanopartikeln einen hohen spezifischen Widerstand erzeugen79. Darüber hinaus ist GO-Nanomaterial als schlechter Leiter bekannt65 und weist 29,4 % des Sauerstoffs auf, der sauerstoffhaltigen Gruppen zugeschrieben wird (Tabelle S1), die die ausgedehnte sp2-hybridisierte Kohlenstoffstruktur stören. Insgesamt konnten wir keine Hinweise darauf finden, dass die elektrischen Eigenschaften zur Zelldifferenzierungsreaktion beitragen.

Schließlich wurde bereits früher nachgewiesen, dass Oberflächentopographie und -steifigkeit eine grundlegende Rolle beim Kontakt zwischen Zellmembran und Substraten spielen (Abb. 6C). Diese biophysikalischen Hinweise können verschiedene Zellverankerungs- und mechanosensitive Wege fördern, die eine Neuordnung des zellulären Zytoskeletts bewirken und eine Kaskade von Transduktionssignalen auslösen, die die Zelldifferenzierung modulieren28,52. Obwohl Lee et al.80 beobachteten, dass Nanomuster auf rGO- und GO-Filmen das Neuritenwachstum beeinflussten, zeigten unsere PCL/GBN-Membranen auf mikroskopischer Ebene eine ähnliche Oberflächenrauheit ohne statistische Signifikanz. Aufgrund der Topographie der Membranen auf Mikroebene lag die AFM-basierte Analyse der mechanischen Oberflächensteifigkeit außerhalb des Empfindlichkeitsbereichs der in dieser Studie verwendeten Geräte, und andere makroskopische Eindrucktechniken mussten ebenfalls verworfen werden, da sie das Polymer beschädigten Material. Andererseits beeinflusst die lokale Steifheit stark das Zellschicksal, indem sie Mechanotransduktionskaskaden und Zelldifferenzierung auslöst, und könnte durch die Aggregation/Agglomeration von GBN-Nanopartikeln und das Vorhandensein chemischer Strukturdefekte beeinflusst werden52,81. Die homogene Dispersion von GBNs in Membranmatrizen verstärkt ihre mechanischen Eigenschaften81. Sowohl PCL/Gmec (Abb. 3A) als auch PCL/rGO (Abb. 3C) zeigten Agglomerate auf der Membranoberfläche, während rGO auf der gesamten PCL/rGO-Oberfläche vorhanden war. In PCL/Gmec-Membranen gab es Bereiche, in denen nur PCL nachgewiesen wurde . Für PCL/Ganodic (Abb. 3B) und PCL/GO (Abb. 3D) waren Nanopartikel auf Graphenbasis gut dispergiert. Darüber hinaus führte der Einbau von rGO- und GO-defekten GBNs in die PCL-Polymermatrix zu Topographien im Nanomaßstab, die in Verbindung mit dem Vorhandensein von Kanten- oder Leerstellendefekten zu mechanischem Stress auf zellulärer Ebene führen können, der die Differenzierung fördert. Dennoch enthielten PCL/GBN-Membranen nur 0,67 Gew.-% GBNs in der festen Membran, und daher ist nicht zu erwarten, dass sich die mechanische Steifigkeit auf der Membranoberfläche auf Volumenebene wesentlich ändert.

In dieser Studie wurden PCL/Graphen-basierte Flachmembranen durch Phaseninversionstechnik hergestellt, um zu klären, ob es optimale Eigenschaften von Graphen-basierten Nanomaterialien (GBNs) gibt, die in der PCL-Polymermatrix dispergiert werden können, um die Differenzierung von Astrozyten zu induzieren. Eine Konzentration von 0,67 Gew.-% der verschiedenen GBNs, die durch verschiedene Methoden (Gmec, Ganodic, rGO und GO) synthetisiert wurden, wurde in die PCL-Membranen geladen. Die physikalisch-chemischen, elektrischen und topografischen Eigenschaften der Verbundgerüste wurden ebenso bewertet wie die Proteinadsorptionskapazität und die biologische Funktionalität. Insgesamt zeigte die charakteristische Veränderung der C6-Zellen hin zu einer differenzierten Astrozytenmorphologie in Verbindung mit der hohen Gfap- und Glast-Genexpression und dem Vorhandensein von Nestin-positiven Zellen, dass sowohl PCL/rGO- als auch PCL/GO-Membranen als die günstigsten Substrate fungierten zur Verbesserung der Astrozytendifferenzierung. Diese Ergebnisse könnten durch Folgendes gerechtfertigt werden: (i) das Vorhandensein chemischer Strukturdefekte in rGO- und GO-Nanomaterialien und (ii) die selektive (dh Laminin gegenüber BSA) Proteinadsorptionskapazität von PCL/rGO- und PCL/GO-Membranen. Beide Mechanismen begünstigen die Interaktion der Rezeptoren der Zellmembran mit den adsorbierten Biomolekülen auf PCL/rGO- und PCL/GO-Substraten und den direkten Kontakt mit diesen flachen Membranoberflächen. Die Ergebnisse bestätigten, dass die Differenzierung von Astrozyten durch das Vorhandensein von Defekten moduliert wird. Daher sollten GBNs mit diesen Merkmalen gegenüber kristallinen ausgewählt werden. Darüber hinaus begünstigte die gleichmäßige Verteilung von GO- und rGO-Nanomaterialien über die Membranoberfläche die Zellverankerung an zugänglichen und strategischen Punkten der Zellmembran auf diesen PCL/GBN-Oberflächen sowie das Auswachsen und Keimen von Zellverlängerungen. Es ist bemerkenswert, dass diese biokompatiblen Substrate das Potenzial haben, die Differenzierung von Astrozyten zu induzieren, indem sie nur 0,67 Gew.-% GBNs in die Polymermatrix einbauen, was die Kosten der Membranen nicht wesentlich erhöht und die potenzielle Kontroverse mit zytotoxischen Wirkungen verringert.

Als große Neuheit verglich diese Arbeit systematisch den Einfluss der Eigenschaften von vier verschiedenen GBNs auf die Differenzierung von Astrozyten unter gleichen experimentellen Bedingungen und verteilt auf die gleiche PCL-Polymermatrixplattform, was es ermöglichte, verallgemeinerbare Schlussfolgerungen für zukünftige Untersuchungen zur klinischen Übersetzung dieser Verbundmaterialien zu ziehen .

In dieser Arbeit wurden verschiedene Qualitäten von GBNs verwendet: mechanisch abgeblätterte Graphen/Graphit-Nanoplättchen (Gmec, Av-PLAT-7, erworben von Avanzare Innovación Tecnológica); Graphen mit minimaler Oxidation, hergestellt durch wässrige anodische Exfoliation von Graphit mit Na2SO4 als Hauptelektrolyt und NaCl als Coelektrolyt, wie wir zuvor berichtet haben49 (Ganodic); Graphenoxid-Nanoblätter, dispergiert in destilliertem Wasser bei 4 mg·mL−1 (GO, Graphenea, SA); und rGO, das über eine hydrothermale Reduktionsmethode82 vom kommerziellen GO (Graphenea) erhalten wurde.

Die auf Graphen basierenden Nanomaterialien wurden durch Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), Raman und Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) charakterisiert. FTIR-Spektren wurden unter Verwendung eines Spektrophotometers (Spectrum 65 Two Spectrometer, PerkinElmer, Spanien) und Betrieb im abgeschwächten Totalreflexionsmodus (GladiATR, PIKE Technologies, USA) erhalten. Raman-Spektren wurden mit einem Confocal-Raman NRS-4500-Instrument (Jasco, Spanien) aufgenommen. Eine Anregungswellenlänge von 532 nm wurde mit einem 50 × MPlan FLN 0,8 NA-Objektiv bei einer effektiven Laserleistung von 4,4 mW fokussiert. Die Daten wurden mit der Spectra Manager™-Software gesammelt. XPS wurde auf einem SPECS-System unter einem Druck von 10–7 Pa unter Verwendung einer nicht monochromatischen Al Kα-Röntgenquelle (14 kV bei 175 W) durchgeführt. Für die Messungen wurde von jedem GBN-Pulver ein Pellet hergestellt. XPS-Daten wurden mit der CasaXPS-Software analysiert. Zur Entfaltung der hochauflösenden Spektren von C 1 wurden die Bänder als (symmetrische) Faltung einer Gauß- und einer Lorentz-Funktion (80:20) angepasst, während das Graphitband mit derselben Faltung angepasst wurde, die durch eine Funktion zur Annäherung modifiziert wurde seine asymmetrische Form, insbesondere die asymmetrische Form von Ulrik Gelius, wie sie in der CasaXPS-Software implementiert wurde. Sowohl Raman- als auch XPS-Daten wurden von der Software Origin Pro 2017 weiterverarbeitet.

PCL/Graphen-basierte Flachmembranen wurden durch Phaseninversion unter Anpassung des an anderer Stelle beschriebenen Verfahrens hergestellt82. Die Nanomaterialkonzentration wurde auf der Grundlage früherer Ergebnisse ausgewählt, die bestätigten, dass Membranen, die aus Lösungen mit einer GBN-Beladung über 0,1 Gew.-% hergestellt wurden, schwierig zu handhaben und mechanisch instabil waren83. Darüber hinaus ist die Verwendung einer geringen Menge an GBNs in der Polymermatrix ein wesentlicher Vorteil dieser Technologie, da sie einerseits die potenzielle zytotoxische Exposition der Zellen gegenüber Graphen-Nanomaterialien minimiert, falls diese aus der PCL-Matrix herausgelöst werden und in Andererseits werden die mit Graphen verbundenen Produktionskosten gesenkt. Daher wurden 0,1 Gew.-% GBNs durch Ultraschall im Lösungsmittel N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP, 99 % extrarein, Acros Organics) homogen dispergiert. Die unterschiedlichen Zeiten der Ultraschallbehandlung zur Erzielung 24 Stunden stabiler flüssiger Graphenlösungen betrugen 40 Minuten für Gmec- und GO-Nanomaterialien, 70 Minuten für zuvor exfoliertes Ganodic und 90 Minuten für rGO. Anschließend wurden 15 Gew.-% PCL-Polymer (MW, 80 kDa, Sigma Aldrich) zu den GBNs/NMP-Dispersionen gegeben und 48 Stunden lang bei 37 °C gerührt, bis eine gleichmäßige Lösung entstand. Polymerlösungen wurden auf eine Glasplatte mit einer Dicke von 200 µm für das Gießmesser (Elcometer 3580/2, USA) gegossen, in ein Koagulationsbad aus 100 % Vol./Vol. 2-Propanol (IPA, 99 %, Oppac) getaucht mit Reinstwasser gewaschen, um Lösungsmittelspuren zu entfernen. Schließlich enthielten die synthetisierten Membranen eine theoretische Konzentration von 0,67 Gew.-% GBNs. Zum Vergleich wurden auch Kontrollmembranen hergestellt, die nur PCL (15 Gew.-% PCL in NMP) enthielten.

Die Morphologie und Struktur des Querschnitts und der Oberfläche der PCL/GBN-Flachmembranen wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM, EVO MA 15, Carl Zeiss, Deutschland) bei einer Spannung von 15 kV bestimmt. Für Querschnittsbilder wurden Membranproben in flüssigem Stickstoff eingefroren und gebrochen. Alle Proben wurden über Nacht bei 30 °C unter Vakuum (200 mbar) aufbewahrt und vor der Untersuchung mit Gold bedampft. Zur Untersuchung der Oberflächenporosität (n ≥ 3) und der durchschnittlichen Porengröße (n ≥ 100) wurde die ImageJ-Software verwendet. Um die Dicke (δ) der PCL/GBN-Gerüste zu bestimmen, wurden Membranproben (n ≥ 8) mit einem elektronischen Mikrometer (Serie 293, Mitutoyo, Spanien) gemessen. Darüber hinaus wurde die Volumenporosität (\(\varepsilon\)) mit einem hydrostatischen MS-TS-Wägesystem (Mettler Toledo, Spanien) gemessen und gemäß Gl. berechnet. (1), wobei \({\uprho }_{{\text{m}}}\) die gemessene Dichte der Membranen (n ≥ 3) ist und \({\uprho }_{{\text{t} }}\) ist die theoretische Dichte des PCL-Polymers.

Die elektrischen Eigenschaften der PCL/GBN-Membranen wurden mittels Impedanzspektroskopie mit einer elektrochemischen Workstation (Zennium, Zahner, Deutschland) unter Verwendung einer Direktkontaktmethode bewertet. Die trockenen Membranproben (n \(\ge\) 3) mit einer spezifischen Fläche von 1,3 cm2 wurden in einem externen Halter zwischen den Elektroden platziert. Alle Impedanzmessungen wurden bei Raumtemperatur im potentiostatischen Modus durchgeführt und die Frequenz variierte im Bereich von 1–600 kHz.

Die Oberflächentopographie wurde durch Rasterkraftmikroskopie (AFM, NTegra NT-MDT, Russland) im Halbkontaktmodus unter Verwendung der Siliziumsonde NSG-03 und goldenen Siliziumauslegern mit Resonanzfrequenzen von 47 bis 150 kHz analysiert und durch den quadratischen Mittelwert der Oberflächenrauheit charakterisiert (Quadrat). Darüber hinaus wurde die Benetzbarkeit der Membranoberfläche (n \(\ge\) 11) mit Reinstwasser nach einer Sessile-Drop-Methode mit einem Tropfenformanalysator (DSA25, KRÜSS Scientific, Deutschland) bewertet. Bei der Bewertung der Proteinadsorption wurden 2,5 cm2 PCL/GBN-Membranen zwei Lösungen ausgesetzt: 10 % fötales Rinderserum (FBS, Gibco™) in Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM, Gibco™) und 4 g·L− 1 Rinderserumalbumin (BSA, A9647, p ≥ 98 %, Sigma Aldrich) in Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4). Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die Membranproben zweimal mit PBS gespült und adsorbierte Proteine ​​mit 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) entfernt. Das Gesamtprotein wurde nach dem Protokoll des Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kits (BCA, Pierce™) und unter Verwendung eines Spark®-Mikroplattenlesegeräts (Tecan, Schweiz) quantifiziert. FTIR- und Raman-Spektren wurden auch auf PCL/GBN-Membranen aufgenommen.

Membranproben mit einem Durchmesser von 14 mm wurden auf Glasdeckgläser geklebt, um ein Aufschwimmen zu verhindern, mit 70 % v/v Ethanollösungen (EtOH, > 99,8 %, Honeywell) und UV-Licht sterilisiert und mit sterilem PBS gewaschen, um EtOH-Spuren zu entfernen, alles in einem Laminar-Flow-Schrank.

Zellbiokompatibilität und Astrozytendifferenzierung auf PCL- und PCL/GBN-Membranen wurden mit C6-Rattengliomzellen (CCL-107™, ATCC®) durchgeführt. C6-Zellen wurden in DMEM, angereichert mit 10 % FBS, 1 % nicht-essentieller Aminosäuren (NEAA) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S), bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert. Alle Nahrungsergänzungsmittel wurden von Gibco™ erworben. Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage gewechselt, bis eine Zellkonfluenz von 80 % erreicht war. Anschließend wurden C6-Zellen gleichmäßig (3,2 × 104 Zellen pro cm2) auf Flachmembranen ausgesät. Nach 24 Stunden wurde die Astrozytendifferenzierung für 5 Tage unter Verwendung von 0,5 % FBS in DMEM, das 1 mM Dibutyryl-cAMP (dbcAMP, Sigma Aldrich) enthielt, induziert. Die Ergebnisse wurden mit Glasdeckgläsern als Positivkontrolle verglichen.

Auf Flachmembranen kultivierte Zellen wurden mit frischem 3,7 % Paraformaldehyd in PBS 15 Minuten lang fixiert, mit Triton X-100 (0,5 % in PBS) 5 Minuten lang permeabilisiert und mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Proben 30 Minuten lang in Phalloidin-FITC-Konjugat (Sigma Aldrich) inkubiert, auf Objektträger mit Antifade-Medium Vectashield (VectorLabs) konjugiert mit DAPI (4´, 6-Diamidino-2-phenylindol) montiert und unter einem LSM510 untersucht (Zeiss) Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40-fach- und 63-fach-Ölobjektiv (1,4 NA).

Die C6-Zelldifferenzierung wurde auf PCL- und PCL/GBN-Membranen durch Durchführung einer morphometrischen Analyse der Größe und Form der Zellen in jedem konfokalen Bild (n \(\ge\) 4) mit der ImageJ-Software sowie durch RT-qPCR und Western Blot bewertet Techniken. Sowohl RT-qPCR- als auch Western-Blot-Ergebnisse wurden mit Zellkulturen auf TCPs (Tissue Culture Plastics, Positivkontrolle) verglichen.

Für RT-qPCR-Studien wurde die Gesamt-RNA einzeln aus C6-Gliomzellen jeder Versuchsgruppe mit Trizol-Reagenz (Invitrogen) extrahiert und mit dem RNeasy-Kit (Qiagen) gereinigt. Die Konzentrationen der Gesamt-RNA wurden mit einem NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer (Nanodrop Technologies, Spanien) bestimmt. 150 ng gereinigte RNA wurden mit einem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) unter Verwendung von Zufallshexameren als Primer revers in Erststrang-cDNA transkribiert. Die Expression von Gfap- und Glast-mRNAs wurde durch RT-qPCR unter Verwendung genspezifischer SYBR Green-basierter Primer (Invitrogen) bestimmt. Jeder RT-qPCR-Assay wurde dreifach durchgeführt. Der Schwellenwertzyklus (Ct) für jede Vertiefung wurde bestimmt und die Ergebnisse auf Gapdh als Referenz normiert. Die relative Genexpression wurde gemäß der 2−(ΔΔCt)-Gleichung berechnet. Die DNA-Sequenzen der in dieser Studie verwendeten Primer waren wie folgt: Gfap vorwärts 5ʹ-CCAAACTGGCTGACGTTTACC-3ʹ, Gfap rückwärts 5ʹ-TGGTTTCATCTTGGAGCTTCTG -3ʹ, Glast vorwärts 5ʹ- GGCTGCGGGCATTCCTC-3ʹ, Glast rückwärts 5ʹ-CGGAGACGATCCAAGAACCA-3ʹ, Gapdh vorwärts 5ʹ- CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3ʹ und Gapdh kehren 5ʹ-CCACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3ʹ um.

Für das Western Blot wurden 5 Tage lang kultivierte C6-Zellen von PCL/GBN-Membranen und TCP abgekratzt und in 1 × Laemmli-Puffer (2 % SDS, 0,1 % 2-Mercaptoethanol, 10 % Glycerin, 0,0005 % Bromphenolblau und 63 mM) resuspendiert Tris-HCl pH 6,8), ergänzt mit einem vollständigen Protease-Inhibitor-Cocktail. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 100 °C gekocht und durch 5-minütige Zentrifugation bei 11.000 U/min bei 4 °C geklärt. Gleiche Mengen an Proteinen wurden 4–20 % Nu-Page TG-Polyacrylamid-SDS-PAGE-Gelen (Invitrogen) ausgesetzt und auf Nitrozellulosemembranen (0,2 µm Porengröße, Life Technologies) übertragen. Anschließend wurden die Membranen zweimal mit 0,1 % Tween-20 (PBS-T) gespült und mit 5 % fettfreier Trockenmilch (Biorad) in TBS/Tw blockiert. Schließlich wurden die Membranen mit primären polyklonalen Kaninchen-Anti-Nestin-Antikörpern (Sigma Aldrich, Verdünnung 1:5000 in PBS-T) und polyklonalen Ziegen-Anti-β-Actin-Primärantikörpern (Abcam, Verdünnung 1:1000 in PBS-T) inkubiert und weiter geschüttelt bei 4 °C über Nacht. Anschließend wurden die Membranen 1 Stunde lang mit spezifischen Anti-Kaninchen- und Anti-Ziegen-Sekundärantikörpern (Rockland Immunochemicals, Verdünnung 1:5000 in PBS-T) bei Raumtemperatur inkubiert. Proteinbanden wurden mit einem Odyssey™ Infrarot-Bildgebungssystem (Li-Cor Biosciences, USA) nachgewiesen und mit der ImageJ-Software quantifiziert.

Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Für alle Charakterisierungen wurde eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, um festzustellen, ob es signifikante Unterschiede zwischen den als Referenz verwendeten PCL-Membranen und den PCL/GBN-Membranen gab. Das statistische Signifikanzniveau wurde bei p \(<\) 0,05 definiert.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten RT-PCR-Genexpressionsdatensätze sind im Zenodo-Repository verfügbar (https://doi.org/10.5281/zenodo.6874249).

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Die Autoren danken Aleksandra Pacuła (Jerzy-Haber-Institut für Katalyse und Oberflächenchemie, Polnische Akademie der Wissenschaften) für die AFM-Messungen. MM-O dankt dem FPU-Stipendium (19/02324), das vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten vergeben wurde.

Diese Forschung wurde durch die Projekte PID2019-105827RB-I00 und PCI2018-092929 (5. EIG-Concert Japan Joint Call) unterstützt, die von MCIN/AEI/10.13039/5 finanziert wurden „Marquis de Valdecilla Research Institute“, Santander, Spanien (IDIVAL, Förderprogramm APG10). Teilweise Unterstützung wurde auch vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (MICINN), der staatlichen Forschungsagentur (AEI) und dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) bereitgestellt. Wissenschaft, Technologie und Innovation (PCTI) 2018–2022 des Fürstentums Asturien und EFRE durch Projekt IDI/2021/0

Abteilung für Chemie- und Biomolekulartechnik, Universität Kantabrien, Avda. Los Castros s/n, 39005, Santander, Spanien

Marian Mantecon-Oria, Maria J. Rivero, Nazely Diban und Ane Urtiaga

Institut Marqués de Valdecilla (IDIVAL), 39011, Santander, Spanien

Marian Mantecon-Oria, Miguel Lafarga, Maria T. Berciano, Nazely Diban und Ane Urtiaga

Forschungsgruppe für Lebensmittel, Ernährungsbiochemie und Gesundheit, Europäische Universität des Atlantiks, 39011, Santander, Spanien

Olga Tapia

Netzwerk Biomedizinisches Forschungszentrum für neurodegenerative Erkrankungen (CIBERNED), 28029, Madrid, Spanien

Olga Tapia, Michael Lafarga und Maria T. Berciano

Abteilung für Anatomie und Zellbiologie, Universität Kantabrien, 39011, Santander, Spanien

Miguel Lafarga

Abteilung für Molekularbiologie, Universität Kantabrien, 39011, Santander, Spanien

Maria T. Berciano

Institut für Kohlenstoffwissenschaft und -technologie, INCAR-CSIC, C/Francisco Pintado Fe 26, 33011, Oviedo, Spanien

Jose M. Munuera, Silvia Villar-Rodil und Juan I. Paredes

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MM-O.: Schreiben, Datenerfassung, Methodik, Datenverarbeitung. OT: Methodik, Supervision, schriftliche Überprüfung. ML: Schreiben, Rezensieren und Bearbeiten. MTB: Schreiben, Rezensieren und Bearbeiten. JMM: Methodik, schriftliche Rezension. SV: Methodik, Datenerhebung. JIP: Betreuung, schriftliche Überprüfung und Bearbeitung. MJR: Methodendesign, Supervision, schriftliche Überprüfung und Bearbeitung. ND: Methodenkonzeption und -design, Supervision, schriftliche Überprüfung und Bearbeitung. AU: Methodendesign, schriftliche Überprüfung und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Nazely Diban.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mantecón-Oria, M., Tapia, O., Lafarga, M. et al. Einfluss der Eigenschaften verschiedener graphenbasierter Nanomaterialien, die in Polycaprolacton-Membranen dispergiert sind, auf die Differenzierung von Astrozyten. Sci Rep 12, 13408 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17697-9

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Eingegangen: 16. Mai 2022

Angenommen: 29. Juli 2022

Veröffentlicht: 04. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17697-9

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