3D-Chromatin-Remodellierung in der Keimbahn moduliert die evolutionäre Plastizität des Genoms

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2608 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Chromosomenfaltung hat tiefgreifende Auswirkungen auf die Genregulation, deren evolutionäre Folgen noch lange nicht verstanden sind. Hier untersuchen wir den Zusammenhang zwischen dem 3D-Chromatin-Remodelling in Keimzellen von Mäusen und evolutionären Veränderungen in der Genomstruktur. Mithilfe einer umfassenden integrativen Computeranalyse rekonstruieren wir (i) sieben angestammte Nagetiergenome, indem wir Gesamtgenomsequenzen von 14 Arten, Vertretern der wichtigsten Phylogruppen, analysieren, (ii) linienspezifische Chromosomenumlagerungen erkennen und (iii) die Dynamik der strukturellen und strukturellen Veränderungen identifizieren epigenetische Eigenschaften evolutionärer Bruchpunktregionen (EBRs) während der gesamten Mausspermatogenese. Unsere Ergebnisse zeigen, dass EBRs in primären Spermatozyten keine programmierten meiotischen DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) und meiotischen Kohäsine aufweisen, in postmeiotischen Zellen jedoch mit DNA-Schädigungsstellen und funktionellen Ferninteraktionsregionen assoziiert sind, die die Chromosomenkonfigurationen der Vorfahren rekapitulieren . Insgesamt schlagen wir ein Modell vor, das die evolutionäre Neuordnung des Genoms mit DNA-Schadensreaktionsmechanismen und der dynamischen räumlichen Genomorganisation von Keimzellen integriert.

Die Enthüllung der genomischen Grundlagen der Artbildung ist eine Hauptforschungspriorität in der Biologie, die durch die Verfügbarkeit einer beispiellos großen Anzahl genomischer Ressourcen vorangetrieben wird. Vergleichende Genomstudien sowohl nah als auch entfernt verwandter Säugetierarten haben gezeigt, dass Genomregionen, die an strukturellen evolutionären Veränderungen beteiligt sind, in Regionen gehäuft sind, die anfälliger für Brüche und Reorganisationen sind1,2,3,4. In diesem Zusammenhang gelten evolutionäre Breakpoint-Regionen (EBRs) als genomische Regionen, die an strukturellen evolutionären Veränderungen beteiligt sind, die genomische syntenische Regionen stören1,2,3,4. Bei der Suche nach dem Ursprung und den funktionellen Auswirkungen dieser evolutionären Neuordnungen hat die Forschung auf sich wiederholende Elemente als mögliche Treiber hingewiesen1,5,6, während Veränderungen in der Genexpression, die durch die Neuordnung des Genoms verursacht werden, einen selektiven Vorteil durch die Entwicklung neuer adaptiver Merkmale bieten können, die spezifisch für sind Säugetierlinien3,4,7,8,9. Angesichts der Vielfalt der mit EBRs verbundenen Faktoren ist es höchst unwahrscheinlich, dass die Sequenzzusammensetzung von Genomen allein für die genomische Instabilität während der Evolution verantwortlich ist und dass die Regulierung der 3D-Genomfaltung ebenfalls ein entscheidender Faktor ist8,10,11,12.

Säugetiergenome sind in einer Chromatinstruktur verpackt, deren Regulierung von mehreren übereinanderliegenden Organisationsschichten abhängt, einschließlich Chromosomengebieten, in denen Chromatin in Kompartimenten (offen/geschlossen) organisiert ist, die wiederum aus topologisch assoziierten Domänen (TADs) und DNA bestehen Schleifen10,13,14. Die Charakterisierung der Entwicklung der Chromatinkonformation und der DNA-Protein-Wechselwirkungen während der Diversifizierung von Säugetieren liefert eine neue Interpretationshypothese über die Mechanismen, die für die Entstehung der Genomarchitektur und -plastizität verantwortlich sind10,15,16. Entfernte Orte innerhalb des Genoms interagieren während des Zellzyklus auf regulatorische Weise12,14,15 und beeinflussen ihre endgültige Funktion. Dies bietet die Grundlage für die Erforschung der Dynamik der Genomzusammensetzung, der evolutionären Beziehungen zwischen Arten und auf lange Sicht der Artbildung. Diese Ansicht wurde durch das „Integrative Breakage Model“ vereinheitlicht, eine interpretative Evolutionshypothese, die besagt, dass die Zulässigkeit genomischer Regionen zur Reorganisation durch die Chromatinstruktur höherer Ordnung bestimmt werden kann10,11.

Wie bei jeder evolutionären Zustandsänderung können chromosomale Reorganisationen, die in der Keimbahn vor der Meiose (proliferierende Urkeimzellen, Spermatogonien und Oogonien), während der meiotischen Teilung (Spermatozyten und Eizellen) oder in postmeiotischen Stadien (d. h. runde Spermatiden) entstehen, dazu führen an nachfolgende Generationen weitergegeben werden. In solchen Fällen können chromosomale Reorganisationen den Genfluss verringern und möglicherweise zur Artbildung beitragen, indem sie die Rekombination in den reorganisierten Regionen zwischen chromosomal unterschiedlichen, aber zusammenhängenden Populationen unterdrücken16,17,18,19. Geringe Rekombinationsgrade könnten zu einer hohen Divergenz und Fixierung neuer Mutationen in diesen Regionen führen20, was in Kombination mit dem Vorhandensein von Genen, die mit artspezifischem Evolutionsdruck zusammenhängen, den adaptiven Wert von EBRs in der Keimbahn verstärken könnte8. Theoretische Arbeiten deuten darauf hin, dass vererbbare Umlagerungen in Genomregionen auftreten würden, die in Keimzellen und/oder frühen totipotenten Entwicklungsstadien zugänglich sind10, was die Existenz einer einschränkenden Rolle von EBRs in der Keimbahn unterstreicht, die weiterer Untersuchung bedarf.

Während der Spermatogenese können verschiedene Quellen potenzieller genomischer Strukturveränderungen auftreten: (i) Bildung und Reparatur durch homologe Rekombination (HR) und nicht-allelische homologe Rekombination (NAHR) von meiotisch programmierten Doppelstrangbrüchen (DSBs), die durch SPO11 in frühen Stadien der Prophase katalysiert werden I (d. h. primäre Spermatozyten im Leptoten- und Pachytenstadium)21, (ii) Nicht-Disjunktion und meiotischer Antrieb in Meiose I und II22, (iii) Bildung und Reparatur durch nicht-homologe DNA-Endverbindung (NHEJ) oder durch Mikrohomologie vermitteltes Ende Verbindung (MMEJ) von DSBs, die in späteren Stadien der Spermatogenese erzeugt werden (z. B. runde Spermatiden)23,24 und (iv) zygotische Reparatur von SSBs (Einzelstrangbrüchen) und DSBs, die durch oxidative Schäden in reifen Spermien erzeugt werden25. Darüber hinaus gibt es eine Feinabstimmung zwischen Chromatin-Remodellierung, Architekturproteinen und zellspezifischer Genexpression während der Spermatogenese12,16,26,27, die sich auf die möglichen Folgen genetischer Schäden in der Keimbahn auswirken kann. Es ist jedoch nicht bekannt, welche dieser Quellen am meisten zur Bildung übertragbarer evolutionärer Chromosomenreorganisationen beitragen.

Hier untersuchen wir, wie die 3D-Genomfaltung mit den funktionellen und epigenetischen Merkmalen evolutionärer chromosomaler Reorganisationen in der Keimbahn der Maus zusammenhängt. Zu diesem Zweck rekonstruieren wir (i) die Genome von Vorfahren von Nagetieren, indem wir Sequenzen des gesamten Genoms von 14 Nagetierarten, die Vertreter der wichtigsten Phylogruppen sind, analysieren, (ii) linienspezifische Chromosomenumlagerungen erkennen und (iii) die Dynamik der strukturellen und epigenetischen Eigenschaften von Nagetieren identifizieren EBRs durch Mausspermatogenese durch Anwendung integrativer Computeranalysen.

Wir stellen fest, dass sich EBRs in Chromatinumgebungen befinden, die mit fortschreitender Meiose, insbesondere in postmeiotischen Stadien, zugänglicher werden. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass EBRs in primären Spermatozyten keine programmierten meiotischen DSBs und meiotischen Kohäsine aufweisen, jedoch mit funktionellen Ferninteraktionsregionen und DNA-Schadensstellen in postmeiotischen Zellen assoziiert sind. Insgesamt schlagen wir ein Modell vor, das die evolutionäre Neuordnung des Genoms mit DNA-Schadensreaktionsmechanismen und der dynamischen räumlichen Genomorganisation von Keimzellen integriert. Daher stellen wir das Vorhandensein weitreichender Wechselwirkungen bei Spermatiden fest, die evolutionäre syntenische Assoziationen rekapitulieren, die beim Muridae-Vorfahren vorhanden waren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die 3D-Genomorganisation postmeiotischer Zellen (dh Spermatiden) einen wesentlichen Beitrag zur Bildung übertragbarer evolutionärer chromosomaler Reorganisationen leistet.

Um die evolutionäre Neuordnung von Nagetiergenomen zu bewerten, verwendeten wir DESCHRAMBLER28 mit 14 Rodentia-Genomanordnungen auf Chromosomenebene und zwei Außengruppen (Mensch und Kaninchen) (Ergänzungstabelle 1). Die in die Studie einbezogenen Nagetierarten waren Vertreter der wichtigsten Phylogruppen mit diploiden Zahlen zwischen 22 und 72 Chromosomen. Wir haben zunächst die rekonstruierten Ahnenchromosomenfragmente (RACFs) für sieben Vorfahren in der Nagetierlinie (Muridae, Eumuroidea, Muroidea, Myodonta, Mouse Clade, Mouse Clade + Ctenohystricia und Rodentia) definiert (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). Nach manueller Kuration (siehe Methoden) variierte die endgültige Anzahl der RACFs von 26 beim Eumuroidea-Vorfahren bis 35 bei der Mausgruppe und den Myodonta-Vorfahren (Tabelle 1). Die Abdeckung des Mausgenoms reichte von 92,92 % beim Rodentia-Vorfahren bis zu 97,71 % beim Muridae-Vorfahren (Tabelle 1).

Ein phylogenetischer Baum, der aus den paarweisen Divergenzzeiten zwischen der Hausmaus und jeder Nagetierart erstellt wurde, ermöglicht die Rekonstruktion der Karyotypen für sieben Vorfahren von Rodentia bis zur Maus. Für jeden Knoten werden die chromosomalen Umlagerungen zwischen den Vorfahren angezeigt: in Blau die Anzahl der Inversionen, in Rot die Anzahl der interchromosomalen Umlagerungen. Grüne Punkte kennzeichnen die Abstammungslinien der Vorfahren; Blaue Punkte stellen aktuelle Vorfahren dar (Muridae, Eumoroidea, Muroidea bzw. Myodonta). Das Rot zeigt die Maus. B Rekonstruierte Ahnenkaryotypen für die Vorfahren Rodentia, Muroidea und Maus, gefärbt nach Rodentia-RACFs. Die kleineren RACFs (weniger als 26 MB) werden als nicht platziertes Chromosom (Un) angezeigt. C Paarweiser Vergleich zwischen den Vorfahren der Eumuroidea und Muridae. Jedes Band stellt die syntenischen Fragmente zwischen den Vorfahren dar, geneigte Bänder zeigen Inversionen an. Syntenic-Fragmente sind entsprechend den Rodentia-RACFs gefärbt. Abkürzungen – MYA Millionen Jahre, Unplatzierte Fragmente.

Da unser Ansatz RACFs vorhersagt, die in einigen Fällen möglicherweise nicht die vollständigen Chromosomen der Vorfahren darstellen, haben wir die Anzahl der Chromosomen der Vorfahren auf RACFs ≥ 26 Mbp geschätzt, die Länge des kleinsten Chromosoms in den verwendeten Zusammenstellungen29 (siehe Methoden). Unsere Ergebnisse sagten die gleiche Anzahl von Ahnenchromosomen bei Eumuroidea (haploides Komplement, n = 24), eines mehr bei den Vorfahren von Rodentia (n = 26) und Muroidea (n = 27) und eines weniger bei Muridae (n = 24) voraus zuvor anhand zytogenetischer Vergleiche berichtet (Tabelle 1). Trotz dieser Unterschiede stellen unsere Ergebnisse die große Mehrheit der syntenischen Assoziationen beim Muridae-Vorfahren wieder her, über die zuvor unter Verwendung des Mausgenoms (Mus musculus Domesticus, MMU) als Referenz berichtet wurde. Insbesondere konnten wir mit Ausnahme von MMU12/17 sieben syntenische Assoziationen erkennen (MMU7/19, MMU5/11, MMU16/11, MMU13/15, MMU2/13, MMU1/17 und MMU17/10). Die hohe Auflösung unseres genomischen Vergleichsansatzes, die die Identifizierung kleiner Umlagerungen ermöglichte, ermöglichte es uns, drei syntenische Assoziationen im Muridae-Vorfahren (MMU5/6, MMU11/17 und MMU5/12) zu erkennen, die zuvor mithilfe der Zytogenetik nicht beschrieben wurden (ergänzende Abbildung 1). ). Für Eumuroidea- und Muroidea-Vorfahren stellen unsere Daten 7/8 syntenische Assoziationen wieder her, was auf ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen den Methoden hinweist (ergänzende Abbildung 1).

Unter Verwendung des Mausgenoms als Referenz ermöglichte uns unser genomischer Ansatz die Identifizierung von insgesamt 232 EBRs unter Berücksichtigung aller Abstammungslinien (Tabelle 1). Die EBR-Größen variierten zwischen 2 bp und 3,7 Mbp mit einer mittleren Größe von 21,5 Kbp (ergänzende Abbildung 2). Diese EBRs befinden sich in Regionen mit hoher Gendichte (Permutationstest basierend auf 10.000 Permutationen, Z-Score 7,46, p-Wert 0,001) und kolokalisiert mit transponierbaren Elementen, insbesondere ERVs (Permutationstest basierend auf 10.000 Permutationen, Z-Score 4,57, S Wert 0,001, Ergänzungstabelle 2). Insgesamt 2524 Gene befanden sich in EBRs und wurden mit Begriffen der Genontologie (GO) im Zusammenhang mit der Immunantwort [134 Gene, Falscherkennungsrate (FDR) 7,18E−36] und der Chromatin-Stummschaltung (11 Gene, FDR 0,00925) angereichert (Ergänzung). Abb. 3).

Anschließend klassifizierten wir EBRs phylogenetisch basierend auf der Abstammungslinie, in der sie vorkamen, und reichten von 4 bis 75 EBRs beim Rodentia- bzw. Muroidea-Vorfahren (Tabelle 1). Unter Verwendung der identifizierten EBRs berechneten wir dann die Umlagerungsraten als Anzahl der EBRs pro Zweiglänge zwischen den Vorfahren in Millionen Jahren (My), die zwischen 0,40 und 27,27 EBRs/My beim Vorfahren aller Nagetiere bzw. beim Vorfahren der Mäusegruppe lagen ( Tabelle 1 und Abb. 1). Der Vorfahre der Mausgruppe zeigte eine höhere Chromosomenumlagerungsrate als die erwartete durchschnittliche Rate der Chromosomenumlagerungen (3,18 EBRs/My, χ2-Test, p-Wert <0,001). EBRs wurden weiter danach klassifiziert, ob sie Inversions- (N = 128) oder Nicht-Inversions-EBRs (N = 104) abgrenzen, wenn sie mit einer Fusion oder Spaltung verbunden sind, und schließlich in angestammte (N = 44), neuere (N) gruppiert = 134) oder mausspezifische EBRs (N = 54), unabhängig davon, ob sie vor oder nach der Spaltung von Myodonta auftraten oder nur im Mausgenom vorhanden sind (Tabelle 1).

Anschließend haben wir die Anzahl und Art der chromosomalen Umlagerungen bestimmt, die bei jedem Vorfahren vom Rodentia-Vorfahren zur Maus vorhanden waren. Insgesamt wurden 240 chromosomale Umlagerungen, bestehend aus interchromosomalen Spaltungen und Fusionen (N = 129) und Inversionen (N = 111), bei sieben verschiedenen Vorfahren identifiziert (Abb. 1 und Tabelle 2). In allen Abstammungslinien kam es sowohl zu inter- als auch intrachromosomalen Umlagerungen. Zwischen Eumuroidea und Muridae-Vorfahren kam es zu sieben Inversionen und zehn Fusionen/Spaltungen. während 22 Inversionen und 32 Fusionen/Spaltungen die evolutionäre Neuordnung zwischen dem Vorfahren der Mausgruppe und Myodonta kennzeichneten (Tabelle 2), was mit der höchsten Umlagerungsrate in der Gruppe übereinstimmt (ergänzende Abbildung 4).

Unsere Ahnenrekonstruktionen ermöglichten es uns, die Genomregionen zu charakterisieren, die 73 My (Millionen Jahre) der Nagetierentwicklung syntenisch erhalten blieben (homologe syntenische Blöcke mehrerer Arten, msHSBs). Wir identifizierten insgesamt 26 msHSBs, die 11,1 % des Mausgenoms abdecken, mit einer Größe zwischen 513 Kbp und 45,68 Mbp und einer durchschnittlichen Länge von 11,61 Mbp. In jedem Mauschromosom war mindestens ein msHSB vorhanden, außer in MMU4, MMU5, MMU7, MMU9 und MMU14, was darauf hinweist, dass diese Chromosomen stark neu angeordnet sind. Insgesamt befanden sich 5282 Gene in msHSBs, angereichert mit GO-Begriffen im Zusammenhang mit dem mitochondrialen Transport (190 Gene, FDR 0,006) und der Erkennung von Reizen (1372 Gene, FDR 9,7e-24) (ergänzende Abbildung 5).

Um die Beziehung zwischen EBRs und der Chromatinstruktur männlicher Keimzellen von Mäusen zu untersuchen, analysierten wir zunächst die Landschaft der Chromatinorganisation höherer Ordnung während der Spermatogenese (Abb. 2A). Zu diesem Zweck haben wir die verfügbaren epigenetischen Chromatindaten30 für Spermatogonien (prämeiotisch), primäre Spermatozyten (meiotisch) und runde Spermatiden (postmeiotisch) erneut analysiert und dabei drei Histonmarkierungen verwendet: aktive assoziierte Histonmodifikationen H3K4me3 und H3K27ac sowie ein unterdrücktes assoziiertes Histon Modifikation (H3K27me3) (Ergänzungstabelle 3). Um methodische Verzerrungen zu vermeiden, haben wir verfügbare ChIP-seq-Datensätze für alle drei Zelltypen (Spermatogonien, primäre Spermatozyten und runde Spermatiden) verwendet, die aus derselben experimentellen Studie stammen (siehe Methoden). Der Prozentsatz des Genoms, der von jedem Histon abgedeckt wird, variierte geringfügig zwischen den Zelltypen. H3K4me3 lag bei Spermatogonien und runden Spermatiden zwischen 1,3 und 4,6 %, H3K27me3 zwischen 1,7 % und 3,8 % und H3K27ac zwischen 1,1 % und 1,3 % des Mausgenoms.

Eine schematische Darstellung der Spermatogenese von Mäusen. Angepasst von 49,70. Für jeden Zelltyp werden diploide (2n) und haploide (n) Zahlen sowie die Anzahl der Chromatiden pro Chromosom (4c, 2c oder c) angegeben. B ChromHMM-Chromatinzustände basierend auf den Markierungen H3K27me3, H3K4me3 und H3K27ac. Die Zahlen in der Tabelle geben den Prozentsatz der Genomabdeckung für Chromatinzustände in den drei analysierten Zelltypen an (Spermatogonien, primäre Spermatozyten und runde Spermatiden). Insgesamt wurden 6 Hauptchromatinzustände gefunden, darunter Hintergrund (Zustand 1, 3 und 7; grau), aktiv (Zustand 2; rot), unterdrückt (Zustand 4; blau), ausgeglichen (Zustand 5; lila und 8; rosa). und dreiwertig (Zustand 6; gelb). C Alluviale Diagramme, die Chromatinzustandsübergänge von Spermatogonien zu primären Spermatozyten und runden Spermatiden darstellen. Die Chromatinzustände 1, 3 und 7 aus Panel (B) wurden in Zustand 0 (Hintergrund) zusammengeführt. D Chromosom 13-Regionsspezifische Heatmaps mit einer Auflösung von 50 kbp (von 55 Mbp bis 65 Mbp) für alle drei Zelltypen mit Darstellung des Kompartimentsignals (A, B), Chromatinzustände, H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3, RNA-seq (dargestellt als log FPKM), CTCF und Kohäsin-Peaks (REC8 und RAD21L) und ATAC-seq. Die genomischen Standorte der EBRs werden in jedem Zelltyp angezeigt (Lachshervorhebung). Abkürzungen – EBRs evolutionäre Bruchpunktregionen, FPKM-Fragmente pro Kilobase Transkript pro Million kartierter Fragmente.

Mithilfe von ChromHMM haben wir ein Chromatin-Zustandsmodell mit einer Auflösung von 200 bp erstellt, das durch acht verschiedene Chromatin-Zustände (von E1 bis E8) in Spermatogonien, primären Spermatozyten und runden Spermatiden definiert ist (Abb. 2B und Ergänzungstabelle 4). Die Zustände E1, E3 und E7 waren dominant und deckten 48,9 %, 78,5 % bzw. 82,3 % des Mausgenoms bei runden Spermatiden, primären Spermatozyten und Spermatogonien ab. Da alle drei Chromatinzustände E1, E3 und E7 eine geringe Abdeckung von Histonmarkierungen aufwiesen, wurden sie als Hintergrundzustand (E0) klassifiziert (Abb. 2B). Der aktive Zustand E2 (angereichert mit H3K27ac) stieg von einer Abdeckung von 1,1 % des Genoms bei Spermatogonien auf 26,4 % bei runden Spermatiden (Abb. 2B). Zustand E4 wurde jedoch von der repressiven Chromatinmarkierung H3K27me3 dominiert, die zwischen 0,31 % und 5,11 % des Genoms in Spermatogonien bzw. runden Spermatiden ausmachte. Was das balancierte Chromatin (Zustände E5 und E8 mit den Markierungen H3K27me3 und H3K4me3) betrifft, reichte es von 13,7 % bei Spermatogonien bis zu 2,92 % bei runden Spermatiden; während der Zustand E6 (gekennzeichnet als dreiwertiges Chromatin mit allen drei Histonmarkierungen) 0,07 % bis 2,94 % der Spermatogonien und Spermatiden abdeckte (Abb. 2B).

Um die Dynamik der Chromatinzustandsübergänge während der Spermatogenese zu beurteilen, verglichen wir den Übergang der Chromatinzustände von Spermatogonien zu Spermatozyten und dann zu runden Spermatiden für eine bestimmte Genomregion (Abb. 2C). Dadurch konnten wir untersuchen, welche Regionen des Mausgenoms während der Spermatogenese aktiviert oder unterdrückt werden. Zu diesem Zweck wurden Genomregionen mit einer Auflösung von 200 bp, die durch sechs verschiedene Chromatinzustände (E0, E2, E4, E5, E6 und E8) definiert sind, zwischen den drei Zelltypen (Spermatogonie, primäre Spermatozyten und runde Spermatiden) verglichen. Dies ergab insgesamt 192 Kombinationen aus Zelltyp und Chromatinzustand, wobei 34 Kombinationen insgesamt > 98 % des Genoms mit jeweils mindestens 0,1 % abdeckten. Der dreiwertige Zustand mit allen drei Histonmarkierungen (E6-E6-E6) wurde ebenfalls einbezogen, was einer Abdeckung von 0,029 % des Mausgenoms entspricht und insgesamt 35 untersuchte Kombinationen ergibt (Abb. 2C, ergänzende Abbildung 6 und ergänzende Tabelle 5). .

Beim Vergleich des Prozentsatzes der Abdeckung jedes Mauschromosoms für jede der 34 häufigsten Chromatinzustandskombinationen stellten wir fest, dass Autosomen eine andere Abdeckung der dreizelligen Typzustände aufweisen als die Geschlechtschromosomen, wobei Zustand E0-E0-E0 die größte Abdeckung aufweist im Bereich von 45,43 % auf Chromosom 11 bis 62,24 % auf Chromosom 3 (ergänzende Abbildung 6). Bei den Geschlechtschromosomen hatte der Zustand E0-E0-E2 die größte Abdeckung (44,71 % auf Chromosom X und 50,76 % auf Chromosom Y). Der Zustand E5-E0-E0 war auf den Geschlechtschromosomen niedriger (X: 1,43 % und Y: 0,31 %), verglichen mit durchschnittlich 6,51 % auf den Autosomen. Der Status E5-E0-E2 verringerte sich auf dem Chromosom Y mit einer Abdeckung von 0,4 %, verglichen mit durchschnittlich 2,3 % auf den Autosomen. Stattdessen stieg der Zustand E0-E0-E8 auf dem Chromosom Y um 3,44 %, verglichen mit durchschnittlich 1,4 % auf den Autosomen.

Wir stellten fest, dass der größte Teil des Genoms (54, 45 %) während der gesamten Spermatogenese im gleichen Hintergrundchromatinzustand (E0-E0-E0) verblieb (ergänzende Abbildung 6). Dies steht im Gegensatz zu dem kleinen Anteil des Genoms, der aktiv (0,084 % in E2-E2-E2), ausgeglichen (0,20 %, E8-E8-E8 und E5-E5-E5 < 0,001 %) und dreiwertig (0,029 % E6) bleibt -E6-E6) oder unterdrückt (0,12 %, E4-E4-E4) in allen drei Zelltypen. Bemerkenswerterweise veränderten 41,09 % des Genoms den Chromatinzustand während der Spermatogenese, wobei E0-E0-E2 der häufigste Übergang war (21,9 % Abdeckung), gefolgt von E5-E0-E0 (6 % Abdeckung). Während der Spermatogenese wurden 25,8 % des Genoms aktiv, wohingegen nur 4,49 % bzw. 1,94 % in einen unterdrückten oder ausgeglichenen Zustand übergingen (Abb. 2C). Im Gegensatz dazu wurden bei Spermatiden insgesamt 2,56 % des Mausgenoms dreiwertig. Sowohl .

Als nächstes haben wir die Genompositionen von EBRs mit Chromatinzuständen und Strukturdatensätzen integriert, einschließlich Hi-C-Daten, CTCF, meiotischen Kohäsinen (REC8 und RAD21L), CpG-Inseln, Transkriptionsstartstellen (TSS), ATAC-seq und RNA-seq (siehe Methoden). ) (Abb. 2D). Insbesondere analysierten wir die 3D-Genomfaltungsdynamik (A/B-Kompartimente und TADs) anhand veröffentlichter Hi-C-Karten, die für Spermatogonien, primäre Spermatozyten und runde Spermatiden erstellt wurden12 und verglichen mit der Dynamik der epigenetischen Landschaftsdynamik (vorheriger Abschnitt). Darüber hinaus wurden CTCF- und meiotische Kohäsin-Bindungsstellen für primäre Spermatozyten und runde Spermatiden einbezogen12. Genomweite Assoziationen verschiedener Datensätze wurden mithilfe von Permutationstests ausgewertet (siehe Methoden).

Wir untersuchten zunächst die epigenetische Landschaft von EBRs, indem wir die Co-Lokalisierung der 35 dreizelligen Zustände mit den genomischen Positionen von EBRs mithilfe eines Multiassoziations-Permutationstests bewerteten (siehe Methoden). Bemerkenswerterweise sind EBRs negativ (Permutationstest basierend auf 10.000 Permutationen, normalisierter Z-Score −0,05, p < 0,05) mit dem Hintergrundzustand (E0-E0-E0) assoziiert, aber stark assoziiert (Permutationstest basierend auf 10.000 Permutationen, normalisierter z -Score > 0,01, p < 0,05) mit aktivem oder balanciertem Chromatin (Abb. 3A und ergänzende Abb. 7). Dieser Zusammenhang war stärker bei Zuständen, die bei Spermatiden zu E6 und E8 übergehen (normalisierter Z-Score > 0,05, p < 0,05), insbesondere bei den EBRs, die in der Mauslinie auftraten, was darauf hindeutet, dass EBRs in Chromatinumgebungen auftreten, die währenddessen zu schnellen Veränderungen neigen Spermatogenese.

A Von regioneR (Multivergleich) erhaltene Heatmaps, die Korrelationen zwischen verschiedenen EBRs (vorfahren, neu und mausspezifisch) und Chromatinzustandsübergängen zwischen Chromatinzuständen (E) in Spermatogonien, primären Spermatozyten und runden Spermatiden zeigen. B-Heatmaps, die von regioneR (Multicomparison) erhalten wurden und Korrelationen zwischen verschiedenen EBRs (vorfahren, neu und mausspezifisch) und TAD-Grenzen, A-Kompartimenten, Kompartimentwechsel (von A nach B und umgekehrt), CpG-Inseln und Transkriptionsstartstellen (TSS) anzeigen die drei Zelltypen. CTCF, Kohäsine (RAD21L und REC8) und ATAC-seq wurden sowohl für primäre Spermatozyten als auch für runde Spermatiden einbezogen. Zu den primären Spermatozyten gehörten auch PRDM9-Stellen (Typ I und II) und DMC1-Stellen. Zu den runden Spermatiden gehörten postmeiotische DSBs. C Interaktionsmetaplots, die die Isolatorwerte für TADs und EBRs in jedem Zelltyp darstellen. D Arbeitsmodell, das die Disposition der Genomfaltung (DNA-Schleifen und Kompartimente) in Bezug auf Kohäsine, CTCF, meiotische DSBs und EBRs darstellt. Bei primären Spermatozyten ragen DNA-Schleifen aus den Chromosomenachsen heraus, wobei meiotische DSBs innerhalb von TADs in A-Kompartimenten vorkommen; EBRs sind mit TAD-Grenzen verbunden. Bei runden Spermatiden sind EBRs mit postmeiotischen DSBs innerhalb von TADs in A-Kompartimenten assoziiert. Abkürzungen – EBRs evolutionäre Bruchpunktregionen, TADs topologische assoziierte Domänen, DSBs Doppelstrangbrüche, FPKM-Fragmente pro Kilobase Transkript pro Million kartierter Fragmente.

Um labile Chromatinlandschaften weiter zu untersuchen, analysierten wir den Geninhalt dieser drei mit EBRs assoziierten Zelltypzustände. In den E6- und E8-Regionen der Spermatiden waren insgesamt 10.925 einzigartige Protein-kodierende Gene vorhanden. Die GO-Anreicherungsanalyse (≥1,5-fache Anreicherung und FDR < 0,5) identifizierte GO-Begriffe im Zusammenhang mit der Proteinlokalisierung bis zur Zellverbindung und der Proteindephosphorylierung (1,79- und 1,55-fach) sowie der Dendritenentwicklung und der Regulierung der Organellenassemblierung (1,57- und 1,51-fach).

Auf grober Strukturebene waren EBRs mit Regionen assoziiert, die ihren Zustand während der Spermatogenese veränderten (alle Assoziationen basierten auf einem Mehrfachpermutationstest auf Basis von 10.000 Permutationen, normalisierter Z-Score > 0,01, p < 0,05) (Abb. 3A und ergänzende Abb. 7) . Insbesondere sind EBRs mit dem „geschlossenen“ B-Kompartiment in prämeiotischen Spermatogonien assoziiert, jedoch mit dem „offenen“ A-Kompartiment in meiotischen Spermatozyten und postmeiotischen Spermatiden (Abb. 3B und ergänzende Abb. 7). In Übereinstimmung damit sind EBRs mit „geschlossenen“ Chromatinumgebungen (E0, E4, E5) in Spermatogonien und „offenen“ Chromatinumgebungen (E2, E6, E8) sowohl in primären Spermatozyten als auch in runden Spermatiden assoziiert. Auch auf einer feineren strukturellen Ebene sind EBRs mit Regionen verbunden, die einem strukturellen Umbau unterliegen. Sie sind mit TAD-Grenzen in Spermatogonien und Spermatozyten verbunden, befinden sich jedoch innerhalb von TADs in runden Spermatiden (Abb. 3B und ergänzende Abb. 7). Obwohl EBRs mit TSS assoziiert waren, weisen diese Regionen in Spermatogonien keine hohen Expressionsniveaus auf, werden jedoch in runden Spermatiden stärker exprimiert (Mann-Whitney-Test, p <2,2e−16) (ergänzende Abbildung 8). Insgesamt legen unsere Ergebnisse nahe, dass sich EBRs bevorzugt in Genomregionen ansiedeln, die mit fortschreitender Spermatogenese zugänglich werden. Darüber hinaus sollten evolutionäre Umlagerungen die TAD-Strukturen in Spermatogonien oder Spermatozyten nicht zerstören, in runden Spermatiden kann dies jedoch der Fall sein.

Als nächstes untersuchten wir, ob die meiotische chromosomale Architektur einen Einfluss auf die Verteilung von EBRs in primären Spermatozyten hatte. Dazu ist es wichtig zu berücksichtigen, dass meiotische Chromosomen in DNA-Schleifen organisiert sind, die an Chromosomenachsen verankert sind, die während der Prophase I vom Synaptonemalen Komplex (SC) gebildet werden, einer Proteinstruktur mit einer reißverschlussartigen Morphologie, die die Synapse homologer Chromosomen vermittelt32. Der SC legt den Kontext fest, in dem Synapse und Rekombination zwischen Homologen stattfinden, indem er Schwesterchromatiden innerhalb der lateralen Komponenten der SC-Achse durch meiotische Kohäsine wie REC833 und RAD21L34 verbindet. Wichtig ist, dass meiotische DSBs zwar an DNA-Schleifen auftreten können, ihre Reparatur jedoch im Zusammenhang mit den Chromosomenachsen erfolgt. Da die Länge der Chromosomenachse umgekehrt mit der Größe der aus dem SC35 austretenden Chromatinschleifen korreliert, ist die Anzahl und Verteilung der DSBs pro Chromosom mit der strukturellen Organisation des Genoms während der Meiose verknüpft22,36.

Auf der Suche nach der evolutionären Plastizität der meiotischen chromosomalen Architektur führten wir Permutationstests (basierend auf 10.000 Permutationen) durch, um den Zusammenhang zwischen EBRs und der genomischen Position von DMC1- und PRDM9-Stellen zusammen mit verschiedenen strukturellen meiotischen Merkmalen wie meiotischen Kohäsinen (RAD21L und REC8) zu bewerten. in primären Spermatozyten. Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass EBRs negativ mit DMC1- und PRDM9-Stellen assoziiert sind (Abb. 3B). EBRs waren sowohl in primären Spermatozyten als auch in runden Spermatiden ebenfalls negativ mit meiotischen Kohäsinen (RAD21L und REC8) assoziiert (Abb. 3A). Obwohl EBRs mit „offenen“ Chromatinumgebungen in primären Spermatozyten (dh E0-E6-E6 und E8-E8-E6) korrelierten (Abb. 3A), waren diese Regionen nicht mit Kohäsinen assoziiert (Ergänzungstabelle 6). Da Kohäsine notwendige Strukturbestandteile der DNA-Schleifen sind, die an den Chromosomenachsen befestigt sind, und die Bildung und Reparatur von DSBs während der Meiose streng reguliert werden, deuten unsere Ergebnisse auf das Vorhandensein einer reinigenden Selektion für das Auftreten groß angelegter chromosomaler Reorganisationen in der Keimbahn hin (Abb. 3C, D). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Beobachtungen einer Verringerung der Rekombinationsraten in EBRs3,8,18.

Da festgestellt wurde, dass evolutionäre Umlagerungen bevorzugt mit genomischen Regionen verbunden sind, die mit fortschreitender Spermatogenese zugänglich werden, analysierten wir anschließend das Auftreten von EBRs im Zusammenhang mit postmeiotischen Zellen (dh runden Spermatiden). Spermatiden sind haploide Zellen mit stark verdichtetem Genom (die meisten Histone werden durch Protamine ersetzt) ​​und sind daher einem einzigartigen Mutationsdruck ausgesetzt. Dazu gehören DSBs, die (möglicherweise als Ergebnis der Topoisomerase-II-Aktivität) gebildet werden, um die Torsion der DNA-Helix zu lindern. Da runden Spermatiden eine Vorlage für eine homologiegesteuerte Reparatur fehlt, müssen DSBs mit fehleranfälligen Methoden wie NHEJ oder MMEJ23,37 repariert werden.

Mithilfe öffentlich verfügbarer Daten (siehe Methoden) identifizierten wir insgesamt 151.732 DSB-Hotspots in Spermatiden (von nun an postmeiotische DSBs), die 1,49 % des Mausgenoms abdecken. Regionen mit postmeiotischen DSBs lagen im Bereich von 146 bp bis 6662 bp, mit einem Mittelwert und einem Median von 267 bp bzw. 213 bp. Die Position dieser postmeiotischen DSBs im Mausgenom korrelierte mit der Chromosomengröße (Pearson-Korrelation, r2 = 0,68, p = 0,00074), wobei längere Chromosomen mehr DSBs ansammelten als kürzere, außer im chrY (3,51 % Abdeckung) (Ergänzung). Abb. 9). Darüber hinaus waren postmeiotische DSBs auch mit Wiederholungsgehalten in jedem Chromosom verbunden (Pearson-Korrelation, r2 = 0,78, p = 0,00003). Insbesondere postmeiotische DSBs, die zusammen mit den transponierbaren Elementen L1Md_T und L1Md_A lokalisiert sind (GAT-Analyse, 1000 Permutationen mit 12,6- und 11,1-fach, p = 0,001).

Auf epigenetischer und struktureller Ebene haben wir festgestellt, dass postmeiotische DSBs tendenziell in Genomregionen auftreten, denen epigenetische Modifikationen fehlen (Zustand E0-E0-E0). Das heißt, DSBs werden in runden Spermatiden tendenziell aus aktiven oder ausgeglichenen epigenetischen Landschaften ausgeschlossen (ergänzende Abbildung 7). Außerdem waren postmeiotische DSBs negativ mit A-Kompartimenten (mehrfacher Permutationstest basierend auf 10.000 Permutationen, normalisierter Z-Score –0,06, p < 0,05) und TAD-Grenzen in runden Spermatiden (normalisierter Z-Score –0,07, p < 0,05) assoziiert ). Bemerkenswerterweise korrelieren postmeiotische DSB-Hotspots positiv mit EBRs (normalisierter Z-Score 0,06, p <0,05, Abb. 3B und ergänzende Abb. 7), was darauf hindeutet, dass EBRs in der Untergruppe der DSBs liegen, die in rundem offenem Chromatin vorkommen Spermatiden. Daher deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass übertragbare genomische Umlagerungen bevorzugt in zugänglichen Genomregionen auftreten, die in postmeiotischen Zellen DNA-Schäden erleiden (Abb. 3D).

Eine verfeinerte Analyse chromosomalspezifischer Hi-C-Karten ergab die Existenz von Genomregionen, die an zellspezifischen weitreichenden intrachromosomalen Interaktionen in runden Spermatiden beteiligt sind, die in Spermatogonien und primären Spermatozyten nicht vorhanden waren. Wir nannten diese Regionen „Intra-LRIs“ (intra-chromosomale weitreichende Interaktionen) und entdeckten das Vorhandensein von 36 Intra-LRIs, die spezifisch für runde Spermatiden sind, die über die Chromosomen 1, 3, 4, 5, 7, 9, 12, 13 verteilt sind. 17 und 19 (Abb. 4 und Ergänzungstabelle 7) mit einer Größe von 0,5 Mbit/s bis 2,05 Mbit/s (mittlere Größe = 0,8 Mbit/s). Der durchschnittliche Abstand zwischen Intra-LRIs betrug 24,2 Mbit/s, und die Interaktionen waren nicht transitiv, d. LRI könnte mit zwei oder mehr „Speichen“-Intra-LRIs im selben Chromosom interagieren (Ergänzungstabelle 8).

A Durch iterative Korrektur und Eigenvektorzerlegung (ICE) korrigierte Hi-C-Matrizen für Chromosom 19 mit einer Auflösung von 100 kbp für die analysierten Zelltypen. Tiefblaue Linien weisen auf nicht kartierte Behälter hin. Langfristige Interaktionen sind in runden Spermatiden hervorgehoben (gelbes Quadrat). B Circos-Diagramm des Mausgenoms, das die verschiedenen identifizierten EBR-Typen (Maus-, Muridae-, Eumuroidea-, Muroidea-, Myodonta-, Rodentia-, Maus-Clade- und Maus-Clade + Ctenohystricia-spezifische) sowie Long-Rage-Interaktionen (LRIs) darstellt. LRIs, die differentiell exprimierte Gene (DEG) enthalten, sind grün dargestellt. C Repräsentatives Beispiel für intrachromosomale weitreichende Wechselwirkungen über eine bestimmte Region von Chromosom 19 (von 14 bis 45 Mbp) in runden Spermatiden von Mäusen. Es werden verschiedene genomische Merkmale angezeigt: A/B-Kompartimente (in Spermatogonien und runden Spermatiden), Chromatinzustände, H3K4me3-Peaks, H3K27ac-Peaks, H3K27me3-Peaks, RNA-seq (dargestellt als log FPKM), CTCF-Peaks und Kohäsin-Peaks (REC8 und RAD21L) . Die genomischen Standorte von EBRs (Lachs-Highlight) und intrachromosomale Ferninteraktionen (Quadrat) werden angezeigt. D Vergrößerung der intrachromosomalen Ferninteraktionen, die in Chromosom 19 erkannt wurden, mit Anzeige von A/B-Kompartimenten, Chromatinzuständen, RNA-Seq (dargestellt als log FPKM) und Genen aus der NCBI Ref Seq-Annotation. Differenziell exprimierte Gene (DEG) werden angezeigt (rote Pfeilspitze). E Vergrößert intrachromosomale Ferninteraktionen, die in Chromosom 7 erkannt wurden, mit Anzeige von A/B-Kompartimenten, Chromatinzuständen, RNA-Seq (dargestellt als log FPKM) und Genen aus der NCBI Ref Seq-Annotation. Differenziell exprimierte Gene (DEG) werden angezeigt (rote Pfeilspitze). F Gene Ontology Enrichment Analysis (GOEA) von Genen, die in intra-chromosomalen und interchromosomalen Long-Range Interactions (LRIs) in runden Spermatiden gefunden werden. Es werden nur signifikante Begriffe der Genontologie (GO) mit einem DAVID-Anreicherungscluster-Score (ES) > 1,3 angezeigt. Der ES basiert auf einem FDR-bereinigten P-Wert (exakter Fisher-Test, zweiseitig). Abkürzungen – EBRs evolutionäre Bruchpunktregionen, LRIs weitreichende Interaktionen, GO-Genontologie, FPKM-Fragmente pro Kilobase Transkript pro Million kartierter Fragmente.

Um die funktionelle Rolle von Genen zu untersuchen, die sich in Intra-LRIs runder Spermatiden befinden, haben wir die in diesen Regionen enthaltenen GO-Begriffe analysiert. Von den insgesamt 691 Genen, die sich in Intra-LRIs befanden, waren 41 % (n = 283) proteinkodierende Gene, wohingegen nicht-kodierende RNAs 34 % der Gesamtzahl ausmachten, gefolgt von Pseudogenen (20 %) und lncRNAs (1,6 %). . Die restlichen 3,4 % der in Intra-LRIs enthaltenen Gene waren nicht annotierte Transkripte. Bei der Analyse von GO-Begriffen stellten wir fest, dass Intra-LRIs für Gene im Zusammenhang mit Sinneswahrnehmung (ES = 13,6), Lipidbiosynthese und Gluconeogenese (ES = 6,27) angereichert waren (p-Wert < 0,05 und Enrichment Score (ES) > 1,3, siehe Methoden). ), Oxidoreduktionsprozesse (ES = 6,97), Reaktion auf Zytokine (ES = 1,94) und Phagozytose (ES = 1,74) (Ergänzende Daten 1). Darüber hinaus waren 33 % dieser Gene Mitglieder relevanter Superfamilien wie Serpinen, Zinkfingerproteine, Geruchsrezeptoren und vomeronasale Rezeptoren. Unter Berücksichtigung der differentiell exprimierten Gene (DEG) in Spermatiden im Vergleich zu Spermatogonien, primären Spermatozyten und Spermien wurden die GO-Begriffe in Intra-LRIs auf Signaltransduktion, Ubiquitinisierung und Chemotaxis eingegrenzt, alles wichtige biologische Prozesse im Zusammenhang mit der Spermatogenese (Abb. 4).

Nachdem die Intra-LRIs charakterisiert waren, stellten wir fest, ob diese Intra-LRIs auch an genomweiten Ferninteraktionen in runden Spermatiden beteiligt waren, und bezeichneten diese als interchromosomale LRIs (Inter-LRIs). Dies geschah durch die Auswahl signifikant höherer Wechselwirkungen (Z-Score-Wechselwirkung >3, siehe Methoden) von Intra-LRIs mit Genomregionen, die sich in anderen Chromosomen befinden (genomweiter Ansatz). Daher haben wir das Vorhandensein von 119 Spermatiden-spezifischen Inter-LRIs festgestellt, an denen verschiedene Mauschromosomen beteiligt sind (dh mehrere Interaktionen) (Abb. 4 und ergänzende Daten 2). Von den insgesamt 864 in Inter-LRIs enthaltenen Genen waren 71 % proteinkodierende Gene, 12 % Pseudogene, 9 % ncRNAs und 7 % lange nichtkodierende RNAs. Was GO-Begriffe betrifft, haben wir eine Anreicherung (p-Wert < 0,05 und ES > 1,3, siehe Methoden) für Gene festgestellt, die mit der negativen Regulierung der Peptidaseaktivität (ES = 2,8), dem G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalweg (ES = 2,4) und Phagozytose (ES = 2,04), Reaktion auf Zytokine (ES = 1,81), Komplementaktivierung (ES = 1,68) und Arachidonsäure-Stoffwechselprozess (ES = 1,5) (Ergänzende Daten 3). Im Gegensatz zum Intra-LRI, wo 11 % (n = 77) der enthaltenden Gene DEG waren, stieg der Prozentsatz der DEGs innerhalb der Inter-LRIs auf bis zu 48,5 % (n = 419), da es sich dabei um Gene handelt, die hauptsächlich mit der Signalübertragung von Zelloberflächenrezeptoren in Zusammenhang stehen Signalweg (ES = 1,66) und Übersetzung (ES = 1,39) (Abb. 4).

Hinsichtlich der strukturellen Konfiguration waren Intra-LRIs signifikant positiv mit Genomregionen assoziiert, die während der Meiose zugänglich wurden (Permutationstest basierend auf 10.000 Permutationen, Z-Score 78,5, p < 0,001) und sich innerhalb von TADs befanden (Z-Score 13,11, S < 0,001). Darüber hinaus waren Intra-LRIs signifikant negativ im Zusammenhang mit CpG-Inseln (Z-Score −11,9, p < 0,001) und meiotischen Kohäsinen wie: REC8 (Z-Score −12,6, p < 0,001), RAD21 (Z-Score −8,8, p < 0,001) und CTCF (Z-Score −3,5, p < 0,001). Andererseits waren Inter-LRIs nicht signifikant mit irgendeinem Strukturmerkmal verbunden.

Um die evolutionären Auswirkungen von LRIs zu verstehen, haben wir analysiert, ob in runden Spermatiden gefundene LRIs mit der Evolutionsgeschichte der Ahnenchromosomen bei Nagetieren zusammenhängen. Zu diesem Zweck analysierten wir das Vorhandensein von LRIs in den syntenischen Assoziationen neuer Nagetiervorfahren, wie Muridae (Maus-Ratte), Eumuroidea (Maus-Ratte-Chinesischer Hamster) und Muroidea (Maus-Ratte-Chinesischer Hamster-Maulwurf-Ratte). ). Von den zehn syntenischen Assoziationen, die beim Muridae-Vorfahren gefunden wurden, waren sieben (70 %) nun durch LRIs in Mäusespermatiden verbunden. Dazu gehörten die Ahnensyntenien MMU7/19, MMU5/11, MMU17/11, MMU13/15, MMU2/13, MMU5/6 und MMU5/12 (Abb. 5). Ebenso sieben syntenische Assoziationen (MMU7/19, MMU5/11, MMU13/15, MMU2/13, MMU12/17, MMU5/8 und MMU5/6) von Eumuroidea und 15 syntenische Assoziationen (MMU7/19, MMU2/13, MMU11). /17, MMU13/15, MMU12/17, MMU1/4, MMU2/4, MMU1/8, MMU5/6, MMU3/5, MMU3/8, MMU17/18, MMU8/15, MMU5/11 und MMU12/14 ) aus Muroidea wurden durch LRIs in Mäusespermatiden verbunden (Ergänzende Abbildung 10 und Ergänzende Daten 4). Der Prozentsatz der Überlappung zwischen LRIs und syntenischen Assoziationen wurde auf 53 bzw. 60 % reduziert, wenn sowohl Eumuroidea-Vorfahren (7 von 13) als auch Muroidea-Vorfahren (15 von 25) berücksichtigt wurden, was darauf hindeutet, dass weitreichende genomische Interaktionen bei runden Spermatiden damit verbunden sind aktuelle Chromosomenzustände der Vorfahren (z. B. Maus-Ratte-Vorfahre).

Ein paarweiser Zirkusplot, der die syntenischen Regionen zwischen dem Maus-Karyotyp und dem Muridae-Vorfahren-Karyotyp (MAK) vergleicht. Inter-LRIs werden in Schwarz und Intra-LRIs in Rot dargestellt. Chromosomen sind farblich nach dem Vorfahren der Muridae kodiert. B Oberes Feld – Schematische Darstellung der verschiedenen Arten evolutionärer Neuordnungen aus dem Karyotyp der Muridae-Vorfahren, einschließlich: einzelne Fusionen, einzelne Spaltungen und komplexe Reorganisationen. Unteres Feld – Schematische Darstellung der 3D-Architektur von LRIs, die in runden Spermatiden gemäß den verschiedenen Arten evolutionärer Umlagerungen gefunden werden. Chromosomen sind farblich nach dem Vorfahren der Muridae kodiert. Abkürzungen – LRIs weitreichende Wechselwirkungen, MAK Muridae-Vorfahrenkaryotyp, MMU Mus musculus Domesticus, chr-Chromosom.

Bei der detaillierteren Analyse der in Muridae-Synten-Assoziationen vorhandenen LRIs unterschieden wir verschiedene Arten von Umlagerungen, einschließlich einzelner Fusionen, einzelner Spaltungen und komplexer Reorganisationen (Abb. 5). Einzelne Fusionen des Muridae-Vorfahren umfassten LRIs in den Mauschromosomen 1, 8 und 17, während einzelne Spaltungen LRIs in den Ahnensyntenien MMU7/19, MMU5/6 und MMU5/11 umfassten. Andererseits waren LRIs in den Chromosomen 2, 13 und 15 an komplexen Reorganisationen beteiligt, die sowohl Fusionen als auch Spaltungen kombinierten. Wichtig ist, dass EBRs, die aus dieser evolutionären Neuordnung resultierten, stark mit LRIs assoziiert waren (Permutationstest basierend auf 10.000 Permutationen, Z-Score = 136,05, p < 0,001). Bemerkenswerterweise befand sich die Mehrheit der Intra-LRIs (75 %) in der Nähe von EBRs (<2 Mbit/s), wobei nur sehr wenige den Haltepunkt überspannten.

Von den 11 beim Muridae-Vorfahren entdeckten Fusions-Spaltungsereignissen waren 8 durch LRIs in runden Spermatiden der Maus verbunden (11 Intra-LRIs und 7 Inter-LRIs). Diese evolutionären LRIs enthielten insgesamt 144 Gene (30 % davon DEG, die in runden Spermatiden exprimiert werden), darunter 83 (57,6 %) proteinkodierende Gene, 35 (24,3 %) Pseudogene und 9 (6,3 %) ncRNAs. Die restlichen 6,3 % waren nicht kommentierte Transkripte. Bei den GO-Begriffen stellten wir eine Anreicherung (p-Wert < 0,05 und ES > 1,3) für Gene fest, die mit der Reaktion auf Pheromon (ES = 8,06), dem Epoxygenase P450-Signalweg (ES = 7,12) und der sensorischen Geruchswahrnehmung (ES = 2,75) assoziiert sind ), einschließlich vomeronasaler und olfaktorischer Rezeptoren. Darüber hinaus waren Gene der exokrinen Drüsen-sekretierenden Peptidfamilie (5 %)38 und Pramel-Gene39 nur in evolutionären LRIs vorhanden, verglichen mit LRIs, die nicht an den Chromosomenkonfigurationen der Vorfahren beteiligt waren.

Hier liefern wir Belege für eine Schlüsselrolle der 3D-Chromatinorganisation bei der Bildung übertragbarer chromosomaler Reorganisationen in der männlichen Keimbahn. Mithilfe eines umfassenden rechnerischen Ansatzes haben wir zunächst sieben Vorfahren der Nagetierlinie mit einem hohen Maß an Genauigkeit rekonstruiert (mehr als 92 % des Mäusegenoms vertreten). Wir zeigen dann, dass EBRs mit Chromatinumgebungen assoziiert sind, die mit fortschreitender Meiose zugänglich werden, insbesondere in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese (d. h. runde Spermatiden), und die anfällig für DNA-Schäden sind. Wichtig ist, dass wir auch das Vorhandensein von postmeiotischen zellspezifischen Ferninteraktionen aufdecken, die nicht nur evolutionäre syntenische Assoziationen rekapitulieren, die beim Muridae-Vorfahren vorhanden waren und zu Spaltungen bei Mäusen führten, sondern auch Ahnenchromosomenfusionen, die neue Mauschromosomen erzeugten.

Unsere Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Interpretation der dynamischen räumlichen Genomorganisation von Keimzellen im Kontext von Keimbahn-DNA-Schadensreaktionen (DDR) und meiotischen Kontrollpunkten (Abb. 6). Während der Gametogenese gibt es zwei Schlüsselwellen der Induktion von DNA-Schäden, die genomische Umlagerungen auslösen können: (i) programmierte meiotische DSBs, die durch SPO11 in frühen Stadien der männlichen und weiblichen Prophase I21 katalysiert werden, und (ii) männerspezifische Induktion von DSBs in sich verlängernden Spermatiden um Torsionsspannungen während der Chromatinkondensation abzubauen40. Hier verwendeten wir die genomische Verteilung von DMC1 zusammen mit PRDM9-Bindungsstellen als Proxy für meiotische DSB-Standorte (SPO11-Oligos-Hotspots41). Da sowohl männliche als auch weibliche meiotische DSBs hauptsächlich durch denselben Mechanismus angetrieben werden (trotz unterschiedlicher Effizienz42), umfassen die analysierten DMC1- und PRDM9-Daten, obwohl sie bei Männern generiert wurden, die Mehrheit der weiblichen meiotischen DSB-Hotspots. Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass Chromosomenumlagerungen nicht mit meiotischen DSBs verbunden waren und die meiotische Chromosomenarchitektur in der Prophase I nicht störten. Obwohl zuvor gezeigt wurde, dass sowohl SPO11-Hotspots als auch H3K4me3-Markierungen positiv mit der Kohäsinbelegung12, A-Kompartimenten12 und offenen Chromatinzuständen korrelierten (dies Studie) in primären Spermatozyten wiesen EBRs (unabhängig vom betrachteten Nagetier-Vorfahren) deutlich keine DMC1- und PRDM9-Stellen auf. Umgekehrt waren EBRs sehr stark mit der Lage von DSB-Hotpots in postmeiotischen Spermatiden verbunden, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass solche DSBs über einen weniger genauen Mechanismus wie NHEJ oder MMEJ repariert werden müssen, da kein Schwesterchromatid vorhanden ist23,37. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass übertragbare Umlagerungen stärker mit männlichen spezifischen postmeiotischen DNA-Schadensstellen assoziiert sind als mit nicht geschlechtsspezifischen meiotischen DSB-Stellen.

Oberes Feld: 3D-Organisation meiotischer Zellen. Spermatogonien stellen eine somatische Organisation dar, bei der das Genom in Kompartimente (A und B) und nachfolgende TADs gefaltet ist. Anschließend kommt es zu einer Abschwächung von Kompartimenten und TADs in primären Spermatozyten (hier beispielhaft dargestellt als Leptoten-, Zygoten-, Pachyten- und Diplotän-Stadien). Postmeiotische Zellen (runde Spermatiden und Spermatozoen) nehmen eine somatisch ähnliche Konfiguration wieder an, allerdings mit Besonderheiten wie der Tatsache, dass die TAD-Grenzen nicht klar definiert sind und weitreichende Wechselwirkungen auftreten12,49. Mittleres Feld: Meiotischer Fortschritt und Kontrollpunkte. Selbsterneuernde Spermatogonien begehen die Meiose. Die primären Spermatozyten meiotische Prophase I, die in vier Stadien unterteilt ist: Leptotän, Zygotän, Pachytän und Diplotän. Die erste und zweite meiotische Teilung führen zu runden Spermatiden, die sich in Spermien differenzieren70. Die Meiose umfasst drei meiotische Kontrollpunkte: (i) Reaktion auf unreparierte Doppelstrangbrüche (DSBs), (ii) Transkriptionsrepression, die als meiotische Stummschaltung von nicht synapsiertem Chromatin (MSUC) bezeichnet wird, und (iii) den Spindelanordnungs-Kontrollpunkt (SAC). Unteres Feld: Quellen genomischer Instabilität. Bei der Spermatogonie überwiegen Spontan-/De-novo-Mutationen und SINEs/LINEs-Aktivität. Meiotisch programmierte DSBs und ihre Reparatur durch nicht-allelische homologe Rekombination (NAHR) sind Quellen struktureller genomischer Veränderungen während der Prophase I, zusammen mit Nicht-Disjunktion während der nachfolgenden meiotischen Teilungen. Die daraus resultierenden strukturellen Veränderungen unterliegen starken selektiven Einschränkungen, da Fehler von jedem der beteiligten meiotischen Kontrollpunkte erkannt werden können. Bei postmeiotischen Zellen (d. h. Spermien) kann eine genomische Instabilität aus oxidativen Schäden und DSBs resultieren, die durch die Entwirrung der Topoisomerase-II-DNA entstehen. Die Reparatur von DSBs erfolgt normalerweise durch nicht homologe Endverknüpfung (NHEJ), ein fehleranfälliger Prozess, der zu strukturellen genomischen Veränderungen führen kann. Da in diesem Stadium keine Kontrollpunkte aktiviert sind (daher werden die selektiven Einschränkungen gelockert), besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass chromosomale Reorganisationen auf die Nachkommen übertragen werden. Abkürzungen – LRIs weitreichende Wechselwirkungen, TADs topologisch assoziierte Domänen.

Die Zulässigkeit einiger Genomregionen, einen Chromosomenbruch zu erleiden, kann auch mit Veränderungen in der Zugänglichkeit des Chromatins verbunden sein3,10,43. Dies wurde kürzlich in somatischen Zellen gezeigt, wo TAD-Grenzen durch induzierte DSBs verstärkt werden, um die Zugänglichkeit der Vielzahl von Proteinen zu ermöglichen, die an DDR44 beteiligt sind. Ebenso wurde gezeigt, dass stark interagierende Regionen normalerweise transkriptionell aktiv sind45 und dass Promotor-Enhancer-Wechselwirkungen durch Chromatin-Remodelling erleichtert werden können46. Diese Ansicht steht im Einklang mit den wachsenden Beweisen, die auf einen Zusammenhang zwischen EBRs und TAD-Grenzen in somatischen Zellen von Säugetieren und Vögeln hinweisen3,10,47,48. Dies stellt jedoch ein Paradox dar, da Umlagerungen, die an TAD-Grenzen stattfinden, selektiv bevorzugt werden, da sie weniger wahrscheinlich die Genregulation stören, die DNA-Strangbrüche, die Umlagerungen auslösen, jedoch eher an offenem Chromatin innerhalb von TADs auftreten. Hier lösen wir dieses Paradox, indem wir zeigen, dass EBRs selektiv mit Regionen assoziiert sind, die in prämeiotischen (Spermatogonie) oder meiotischen (primären Spermatozyten) Zelltypen „geschlossenes“ Chromatin bilden und erst in Spermatiden zu „offenem“ Chromatin werden. Insbesondere liegen diese Regionen bei Spermatiden innerhalb von TADs, bei anderen Zelltypen jedoch in der Nähe der TAD-Grenzen (Abb. 6).

Entscheidend ist, dass unsere Analyse der Kontakthäufigkeitskarten während der Spermatogenese das Vorhandensein zellspezifischer weitreichender Wechselwirkungen entdeckte, die die Chromosomenzustände der Vorfahren rekapitulieren können. Wir haben zuvor gezeigt, dass chromosomale Reorganisationen auf zwei Arten einen Einfluss auf die 3D-Genomtopologie von Keimzellen haben: (i) durch Veränderung der chromosomalen Kernbelegung und (i) durch Neugestaltung von Rekombinationslandschaften16,49. Wichtig ist, dass die Umverteilung der chromosomalen Kernbesetzung in Spermatozyten, die aus chromosomalen Fusionen resultiert, neue genomische Regionen in unmittelbare Nähe bringt, was das Auftreten zusätzlicher Umlagerungen prädisponiert und chromosomale Domänen neuen regulatorischen Umgebungen aussetzt, was möglicherweise die Genexpression und/oder -regulation beeinflusst16. Hier zeigen wir, dass dies der Fall sein kann, was sich im Vorhandensein zellspezifischer weitreichender genomischer Interaktionen in runden Spermatiden von Mäusen widerspiegelt, die Gene enthalten, die für Spermatogenese, Befruchtung und Spermien-Chemotaxis relevant sind. Entscheidend ist, dass relevante interchromosomale Ferninteraktionen, die jetzt in runden Spermatiden der Maus vorhanden sind, Genomregionen entsprechen, die in einzelnen Chromosomen des jüngsten Muridae-Vorfahren vorhanden waren. während aktuelle intrachromosomale Ferninteraktionen in den heutigen runden Spermatiden der Maus Regionen entsprechen, die in zwei oder mehr Chromosomen des Muridae-Vorfahren vorhanden waren.

Wir schlagen daher vor, dass die Landschaft der chromosomalen Reorganisationen (Fusionen und Spaltungen), die während der Genomentwicklung bei Nagetieren stattfanden, mit dem Chromatinkontext zusammenhängt, der jetzt in runden Spermatiden von Mäusen vorhanden ist. Wenn Reorganisationen innerhalb von 3D-Kontaktzentren stattfinden, kann dies entweder interagierende Regionen trennen (intra-in interchromosomale LRIs umwandeln) oder sie umgekehrt zusammenführen. Alternativ können bei Chromosomenspaltungen neue interchromosomale LRIs erstellt werden, um kritische Assoziationen zwischen zuvor zusammenhängenden Regionen aufrechtzuerhalten. Dies ist in der Tat ein entscheidender Aspekt, der die dynamische räumliche Genomorganisation von Keimzellen mit evolutionären chromosomalen Reorganisationen verbindet.

Unser Modell integriert auch die Rolle meiotischer Kontrollpunkte in der evolutionären Plastizität des Genoms. Sobald eine Neuanordnung durch Aufbrechen und erneutes Zusammenfügen der DNA erfolgt ist, muss diese der Eliminierung durch Zellzyklus-Kontrollpunkte und/oder der Lebensfähigkeitsauswahl der resultierenden Nachkommen entgehen. Keimzellen verfügen über ein komplexes Überwachungsnetzwerk, das drei wichtige meiotische Kontrollpunkte umfasst: (i) Reaktion auf nicht reparierte DSBs, (ii) transkriptionelle Unterdrückung, die als meiotische Stummschaltung von nicht synapsiertem Chromatin (MSUC) bezeichnet wird, und (iii) den Spindelanordnungs-Kontrollpunkt (SAC)31. Daher besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass jede Chromosomenumlagerung, die vor oder während der Meiose auftritt, aufgrund der Aktivierung eines dieser drei Kontrollpunkte zu einem meiotischen Stillstand führt (Abb. 6). Darüber hinaus sind bei interchromosomalen Translokationen selbst für den Fall, dass eine solche Umlagerung in prämeiotischen Zellen auftritt und nicht durch die meiotischen Kontrollpunkte eliminiert wird, etwa 50 % der resultierenden Gameten aneuploid und führen wahrscheinlich nicht zu lebensfähigen Nachkommen. Dadurch wird die überwiegende Mehrheit der Umlagerungen, die vor oder während der Meiose auftreten, eliminiert. Diese Ansicht stimmt mit unserer Beobachtung überein, dass EBRs in primären Spermatozyten keine programmierten meiotischen DSBs und meiotischen Kohäsine enthalten. Umgekehrt unterliegen genomische Umlagerungen in postmeiotischen Zellen keinen meiotischen Kontrollpunkten und sind darüber hinaus garantiert euploid, da jede Zelle genau ein haploides Genom enthält. Daher ist die Wahrscheinlichkeit einer Übertragung chromosomaler Reorganisationen, die nach der Meiose auftreten, höher als bei genetischen Beeinträchtigungen, die vor oder während der Meiose auftreten (Abb. 6). Und genau das beobachten wir in unserem rechnerischen Ansatz, da EBRs stark mit genomischen Regionen von DNA-Schäden in runden Spermatiden verbunden sind.

Zusammenfassend legen unsere Beobachtungen nahe, dass der Chromatin-Remodelling während der Spermatogenese einen neuen Rahmen darstellt, in dem evolutionäre genomische Variationen erzeugt und an die Nachkommen weitergegeben werden können. Das Verständnis, wie sich Genominstabilität auf die Genexpression und -regulation in der Keimbahn auswirkt, wird es ermöglichen, die Auswirkungen der Genomumordnung auf Evolution und Reproduktion genauer zu bestimmen.

Die Genomassemblierungen von 14 Rodentia-Artenvertretern der wichtigsten Phylogruppen, zusammengesetzt auf Chromosomenebene oder mit Gerüst N50 > 3 Mbp (Ergänzungstabelle 1), und zwei Säugetierarten außerhalb der Gruppe (Mensch und Kaninchen) wurden verwendet, um paarweise Alignments mit der Maus zu erzeugen Genom (mm10) unter Verwendung von LASTZ mit Standardparametern. LASTZ-Alignments wurden mithilfe der Toolbox-Dienstprogramme von Kent unter Verwendung der Parameter -minScore = 1000, -linearGap = medium, C = 0, E = 30, K = 3000, L = 3000, O = 400 in Ketten- und Netzdateien konvertiert. Das Y-Chromosom war wurde weggelassen, da es schwierig ist, es in ausreichender Qualität zusammenzustellen, sowie die Anreicherung von Wiederholungen und Palindromen im Chromosom50. Die Abdeckung der Netze jeder Art wurde anhand von mm10 berechnet, um die potenzielle Fragmentierung zu minimieren, die bei der Rekonstruktion der Karyotypen der Vorfahren auftritt.

Rekonstruierte Ahnenchromosomenfragmente (RACFs) wurden mit dem DESCHRAMBLER-Algorithmus28 unter Verwendung einer syntenischen Fragmentauflösung von 300 Kbp und einem minimalen Adjazenzwert von 0,0001 generiert. Mit TimeTree51 wurden paarweise Divergenzzeiten zwischen dem Genom der Hausmaus und jeder der untersuchten Arten ermittelt. Die Divergenzzeiten zwischen den Arten wurden dann verwendet, um einen phylogenetischen Baum im Newick-Format zu schreiben und mit FigTree52 zu visualisieren. Wir haben sieben verschiedene Vorfahren in der Nagetierlinie rekonstruiert: Muridae, Eumuroidea, Muroidea, Myodonta, den Vorfahren der mausbezogenen Linie, den Vorfahren aller Nagetiere außer Eichhörnchen und den Rodentia-Vorfahren.

Die Anzahl der von DESCHRAMBLER produzierten RACFs war höher als die Anzahl der Chromosomen, die in früheren Studien vermutet wurde53,54. Folglich wurden die benachbarten RACFs in jedem der rekonstruierten Vorfahren manuell zusammengeführt, wobei sowohl das Referenzgenom als auch andere rekonstruierte Vorfahren, die am engsten verwandt waren, verwendet wurden. Dieser Prozess wurde beim Muridae-Vorfahren begonnen, wobei das Genom der Hausmaus als Bezugspunkt diente, bevor er in der Evolution zurückging und die am nächsten verwandten Vorfahren als Bezugspunkt verwendete. Um die endgültige Anzahl der Ahnenchromosomen zu bestimmen, folgten wir dem Modell, das darauf hindeutet, dass es bei allen Säugetieren eine konservierte Grenze der Chromosomengrößenvariation gibt29. Die durchschnittliche Chromosomenlänge wurde für alle auf Chromosomenebene zusammengesetzten Genome berechnet und die Mindestgrößengrenze wurde auf 26 Mbp geschätzt. RACFs, die kleiner als diese Grenze sind, wurden als nicht platziert gekennzeichnet. Diagramme der RACFs wurden mit dem R-Paket syntenyPlotteR4 erstellt.

Die evolutionären Breakpoint-Regionen (EBRs) in jeder Abstammungslinie wurden anhand des Mausgenoms als Referenz identifiziert. EBRs wurden anhand der Koordinaten manuell zusammengeführter RACFs gezählt. Als Haltepunkt wurde die Mindestgröße aller Abstammungslinien betrachtet. Die EBRs wurden phylogenetisch in Abhängigkeit von der Abstammungslinie, in der sie vorkamen, klassifiziert. EBRs wurden weiter nach der Art der Umlagerung unterschieden, die sie in Inversions-EBRs oder Interchromosomen-EBRs abgrenzten, wenn sie Inversionen abgrenzten oder das Ergebnis von Fusions- bzw. Spaltungsereignissen waren.

Insgesamt wurden 27 Fastq-Dateien von NCBI heruntergeladen (Ergänzungstabelle 3). Die Lesequalität wurde mit FastQC (v0.11.9)55 überprüft. Die Lesevorgänge wurden mit Trimmomatic (v0.39)56 getrimmt, wobei je nach Lesetyp die SE/PE-Einstellung verwendet wurde. Adaptersequenzen wurden mit ILLUMINACLIP entfernt, ebenso Lesevorgänge mit einem durchschnittlichen Phred-Score von <30 oder <20 mit AVGQUAL:20 bzw. 30 für DSB und andere Bibliotheken. MINLEN:30 wurde auch für DSB-Bibliotheken verwendet. Zugeschnittene Fastq-Dateien wurden mit bwa-mem (v0.7.17-r1188)57 auf das Mausgenom mm10 ausgerichtet. Samtools Merge wurde verwendet, um BAM-Dateien mit derselben Histonmarkierung zu kombinieren.

Histonmarkierungsdaten wurden mit MACS2 (v.2.2.7.1)58 analysiert, entweder mit den Standardeinstellungen „Callpeak“, um schmale Peaks zu erzeugen, oder mit „Broad-Broad-Cut-off“ von 0,05, um breite Peaks zu erzeugen. Basierend auf dem ENCODE-Projekt59 wurden Histonmarkierungen als schmal oder breit definiert. Für Markierungen, die nicht in ENCODE definiert sind, wurden die allgemeinen Einstellungen verwendet. ATAC-seq-Daten wurden mit MACS2 (v.2.2.7.1)58 mit den Standardeinstellungen von Callpeak analysiert, um schmale Peaks zu erzeugen. Was die DSBs betrifft, wurden die Daten mit denselben Parametern analysiert, die in der ursprünglichen Studie24 beschrieben wurden. Kurz gesagt wurde MACS2 mit den Standardeinstellungen und –bw600 -q0.01–broad–broad-cutoff 0.1 verwendet. MACS2-Dateien der verschiedenen runden Spermatidenstadien (Stadium 1–9 und Stadium 15–16) wurden zur weiteren Analyse zusammengeführt, um einen Kreuzvergleich mit Datensätzen zu erleichtern, die nicht in verschiedene Entwicklungsstadien bei Spermatiden geschichtet sind. Die längsten DSB-Peaks wurden in IGV (v2.12)60 visualisiert und befinden sich gemeinsam mit großen Abschnitten von Alpha-Satellitenregionen. Da Alpha-Satelliten nicht vollständig in den Zentromeren aller Mauschromosomen zusammengesetzt sind, haben wir diese DSB-Peaks von der weiteren Analyse ausgeschlossen, um eine Verzerrung in Bezug auf die zusammengesetzten Abschnitte der Satellitenregionen zu vermeiden.

ChromHMM (v1.22) wurde für die Chromatin-Zustandsanalyse unter Verwendung der Standard-Bingröße von 200 bp und der verketteten Strategie61 verwendet. Die entsprechende zelltypspezifische Eingabe wurde als Kontrolle verwendet, um den Binarisierungsschwellenwert lokal anzupassen. Nach Abschluss der Binärisierung wurde das Modell mit unterschiedlicher Anzahl von Zuständen erlernt, wobei 8 Zustände (von E1 bis E8) als optimales Modell ausgewählt wurden.

Um herauszufinden, wie sich Chromatinzustände während der Spermatogenese ändern, wurden die genomischen Standorte der Zustände in jedem Zelltyp (Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatiden) mithilfe von Bedtools intersect62 verglichen. Regionen des Genoms, denen in keinem Zelltyp ein chromHMM-Zustand fehlt, wurden entfernt. Die dominanten Zustände in jedem der drei Zelltypen (E7, E3 und E1) wurden zu einem gemeinsamen Zustand namens E0 zusammengeführt. Genomstandorte wurden dann entsprechend den Zuständen in jedem Zelltyp markiert und die Übergänge von einem Chromatinzustand zu einem anderen wurden unter Verwendung von ggalluvial mit ggplot2 in R aufgezeichnet. Aufeinanderfolgende 200-bp-Regionen mit derselben Zustandskombination aus drei Zelltypen wurden zusammengeführt, und 34 Kombinationen mit mehr als 0,1 % genomischer Abdeckung wurden identifiziert. Dieser Grenzwert wurde gewählt, da die Gesamtabdeckung aller dieser Regionen mehr als 98 % des mm10-Genoms ausmachte.

Hi-C-Daten von Mausspermatogonien, primären Spermatozyten und runden Spermatiden wurden von GEO:GSE13205412 erhalten und mit TADbit (v0.2.0.23)63 und HiCExplorer (v3.6)12,64 verarbeitet. Kontaktmatrizen wurden mit einer Auflösung von 50 kb erstellt und auf 100 Millionen Lesevorgänge normalisiert.

Hi-C-Interaktionsmatrizen mit einer Auflösung von 50 Kbp wurden mit HiCExplorer (v3.6) in das Ginteractions-Format exportiert. Intrachromosomale Hi-C-Interaktionsmatrizen wurden als Eingabe verwendet, um Regionen mit großer Reichweite (LRI) für jedes Mauschromosom zu definieren. Dies wurde erreicht, indem 50-Kbp-Bins mit Interaktionen über 100 ausgewählt wurden, die an Bins auftraten, die mindestens 10 Mbp voneinander entfernt waren. Aus den resultierenden Behältern wurden Fehlalarme eliminiert, indem Regionen mit geringer Kartierbarkeit entfernt wurden. Die Kartierbarkeit jeder Region wurde mit GenMap (v1.3)65 berechnet, wobei Regionen mit einer Kartierbarkeit unter 0,5 entfernt wurden. Interchromosomale weitreichende Wechselwirkungen wurden basierend auf einem Z-Score > 3 identifiziert.

Um zu bewerten, ob intrachromosomale LRI-Regionen signifikant stärker mit anderen Regionen im Genom interagieren, haben wir mit Bedtools Shuffle v2.29.262 1000 Sätze von Regionen mit der gleichen Länge und Verteilung wie die intrachromosomalen LRI-Regionen erstellt. Genomregionen, die in den zufälligen 1000 Sätzen enthalten sind, wurden automatisch mithilfe eines internen R-Skripts aus der 50-kb-Spermatidenmatrix für interchromosomale Hi-C-Interaktionen extrahiert. Der Interaktionswert all dieser Regionen wurde dann in einen Z-Score umgewandelt, um die signifikanten Unterschiede zu berücksichtigen.

Unter Verwendung von BioMart v2.46.1 in R v4.0.3 wurden eindeutige proteinkodierende Gen-IDs in mm10 für jede Klassifizierung identifiziert. Diese wurden zur Anreicherung der Genontologie (GO) in den PANTHER db66 eingegeben. Der statistische Überrepräsentationstest wurde entweder mit abgeschlossenem GO-biologischem Prozess oder mit PANTHER-Pfaden (v17.0) ausgewählt. Nur GO-Terme mit ≥1,5-facher Anreicherung und FDR < 0,5 wurden als statistisch signifikant angesehen. Diagramme wurden mit ggplot2 v3.3.5 in R erstellt. Im Fall von LRIs, bei denen nicht-kodierende Transkripte erkannt wurden, wurde DAVID (v6.9) für die GO-Anreicherung verwendet, wobei ein Anreicherungscluster-Score (ES) > 1,3 als Standardparameter berücksichtigt wurde67 .

RNA-seq-Daten von Mausspermatogonien, primären Spermatozyten und runden Spermatiden wurden von GEO:GSE132054 erhalten und mit AIR (https://transcriptomics.sequentiabiotech.com/) verarbeitet12. Die resultierende Expressionsdatei wurde dann gemäß dem Handbuch des R-Pakets zur empirischen Analyse von Genexpressionsdaten analysiert: edgeR (v3.13)68. Anschließend wurde der EdgeR-Algorithmus glmQLFTest mit Standardparametern (p-Wert < 0,05; log2FoldChange = ± 1) verwendet, um die unterschiedlich exprimierten Gene zu bestimmen, wobei Spermatiden als Referenz verwendet wurden.

Die statistische Assoziation zwischen verschiedenen genomischen Merkmalen wurde mithilfe der RegioneR R-Paketversion ausgewertet. 1.2669. Basierend auf dem RegioneR-Paket haben wir eine Reihe von Funktionen erstellt, die die Berechnung von Assoziationen zwischen mehreren Regionsets ermöglichen. Aufgrund der Durchführung mehrerer Vergleiche wurde die p-Wert-Berechnung mithilfe des Benjamini-Hochberg-Verfahrens angepasst. Der Wert des Z-Scores für die Assoziation mit einem angepassten p-Wert größer als 0,005 wurde als 0 betrachtet. Der berechnete Z-Score wurde anschließend normalisiert, indem er durch die Quadratwurzel von n dividiert wurde, wobei n die Anzahl der vorhandenen Regionen ist die permutierte Regionsmenge. Alle Permutationen wurden unter Verwendung von randomizeRegions bzw. NumOverlaps als Randomisierungs- und Bewertungsfunktion durchgeführt. Die genomischen Positionen von Genen, LINEs, LTRs und ERVs für das mm10-Genom wurden vom UCSC-Browser heruntergeladen und als Eingabe für unsere Analyse verwendet.

Die statistischen Analysen wurden mit R durchgeführt. Statistische Parameter und Tests werden bei Bedarf in den Abbildungen und Abbildungslegenden aufgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Hi-C-, RNA-seq- und Kohäsions-ChIP-seq-Datensätze von Mäusen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden aus dem NCBI GEO-Repository abgerufen: GSE132054 (Spermatogonia Hi-C: GSM3840080; Spermatozyten I Hi-C: GSM3840082 und Spermatiden Hi-C: GSM3840083; Spermatogonia RNA-seq: GSM3840094; Spermatozyten I RNA-seq: GSM3840095; Spermatiden RNA-seq: GSM3840096; Spermatozyten I CTCF, RAD21L, REC8: GSM3840086, GSM3840087, GSM3840088 und Spermatiden CTCF, RAD21L, REC8: GSM3840089, GSM3840090, GSM3840091 ).

DSB-Daten von Mäusen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden aus dem ENA-Repository unter dem Zugangscode PRJEB20038 abgerufen. ChIP-Seq-Daten für H3K4me3-, H3K27me3- und H3K27ac-Modifikationen von Mäusen wurden aus dem NCBI GEO-Repository abgerufen: GSE49624 (Spermatogonia H3K4me3, H3K27me3 und H3K27ac: GSM1202705, GSM1202708, GSM1202713; Spermatozyten I H3K4me3, H3K2 7me3 und H3K27ac: GSM1202706, GSM1202709, GSM1202714; Spermatiden H3K4me3, H3K27me3 und H3K27ac: GSM1202707, GSM1202710, GSM1202715; Spermatogonien-Eingabe-DNA: GSM1202723; Spermatozyten I-Eingabe-DNA: GSM1202724 und Spermatiden-Eingabe-DNA: GSM1202725).

ATAC-seq-Daten wurden aus dem NCBI GEO-Repository abgerufen: GSE102954 (Spermatozyten, die ich 1 und 2 repliziere: GSM2751129, GSM2751130 und Spermatiden, die 1 und 2 replizieren: GSM2751133, GSM2751134). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle Funktionen für die Multiassoziationsanalysen finden Sie unter https://github.com/RMalinverni/GenoMatriXeR/ (v1.0.0, https://doi.org/10.5281/zenodo.6379726). Die restlichen verwendeten Funktionen finden Sie unter https://github.com/Farre-lab/EBRs_HiC_Spermatogenesis_paper (v1, https://doi.org/10.5281/zenodo.6376838).

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Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wirtschaft, Industrie und Wettbewerbsfähigkeit (CGL2017-83802-P an AR-H.), dem spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (PID2020-112557GB-I00 an AR-H. und RTI2018-094005-B) unterstützt -I00 an MB), die Agència de Gestió d'Ajuts Universitaris i de Recerca, AGAUR (SGR1215 an AR-H.) und der Leverhulme Trust (RPG-2019-414 194 an PJIE und MF). CV und LA-G. wurden durch FPI-Vordoktorandenstipendien des Ministeriums für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit unterstützt (BES-2015-072924 an CV und PRE-2018-083257 an LA-G.). LM-G. wurde durch ein FPU-Vordoktorandenstipendium des Ministeriums für Wissenschaft, Innovation und Universität (FPU18/03867 an LM-G.) unterstützt. Ein Teil der Analysen wurde mit den speziellen Hochleistungsrechnersystemen der Information Services der University of Kent durchgeführt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lucía Álvarez-González, Frances Burden, Dadakhalandar Doddamani.

Abteilung für Zellbiologie, Physiologie und Immunologie, Autonome Universität Barcelona, ​​​​Cerdanyola del Vallès, Spanien

Lucía Álvarez-González, Cristina Marín-García, Laia Marín-Gual, Albert Gubern, Covadonga Vara, Andreu Paytuví-Gallart und Aurora Ruiz-Herrera

Genomintegritäts- und Instabilitätsgruppe, Institut für Biotechnologie und Biomedizin, Autonome Universität Barcelona, ​​​​Cerdanyola del Vallès, Spanien

Lucía Álvarez-González, Cristina Marín-García, Laia Marín-Gual, Covadonga Vara, Andreu Paytuví-Gallart und Aurora Ruiz-Herrera

School of Bioscience, University of Kent, Canterbury, Großbritannien

Frances Burden, Dadakhalandar Doddamani, Emma Leach, Peter JI Ellis und Marta Farré

Programm für Epigenetik und Biologie von Krebs und Leukämie, Josep Carreras Leukemia Research Institute (IJC), Campus ICO-GTP-UAB, Badalona, ​​Spanien

Roberto Malinverni & Marcus Buschbeck

Sequence Biotech, Barcelona, ​​​​Spanien

Andreu Paytuví-Gallart

Programm für prädiktive und personalisierte Krebsmedizin, Germans Trias i Pujol Research Institute (PMPPC-IGTP), Badalona, ​​Spanien

Marcus Buschbeck

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PJIE, MF und AR-H. konzipierte Experimente. LA-G., FB, DD, RM, EL, CM-G., LM-G., CV, AP-G., AG, PJIE, MF und AR-H. analysierte die Daten. MB, PJIE, MF und AR-H. beigesteuerte Reagenzien und Ressourcen. LA-G., FB, DD, PJIE, MF und AR-H. schrieb den ersten Entwurf des Papiers mit Beiträgen aller Autoren. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Papiers gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Peter JI Ellis, Marta Farré oder Aurora Ruiz-Herrera.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Álvarez-González, L., Burden, F., Doddamani, D. et al. 3D-Chromatin-Remodellierung in der Keimbahn moduliert die evolutionäre Plastizität des Genoms. Nat Commun 13, 2608 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30296-6

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Eingegangen: 22. November 2021

Angenommen: 21. April 2022

Veröffentlicht: 11. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30296-6

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